周述博，張本斯

（大理學(xué)院，云南大理 671000）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是在多種致病因素下使肺血管阻力增高及肺順應(yīng)性減退并肺血管重塑，最終發(fā)展為右心衰竭的一種病理生理過程〔1〕。具體的發(fā)生機制尚不完全清楚，已證實多種體液因素如內(nèi)皮素及生長因子等參與肺血管纖維化的發(fā)病過程，并使肺血管平滑肌細胞的增殖。

匹伐他汀屬于他汀類藥物的新型降脂藥。他汀類藥物現(xiàn)已被證實有抗血管平滑肌增殖、抗炎、抗凋亡及對小G蛋白翻譯后的修飾有抑制作用及中斷細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)〔2〕，其中小G蛋白是一種具有GTP酶活性且分子量小的蛋白。Rac1是小G蛋白的一個亞群，血小板衍生生長因子B（platelet-derived growth factor B，PDGF-B）在血管平滑肌增殖中起重要的調(diào)節(jié)作用，白介素6（interleukin-6，IL-6）是一種重要的炎癥介質(zhì)。所以本文通過Rac1、PDGF-B、IL-6相互研究來進一步闡明肺動脈高壓形成及匹伐他汀在對肺動脈高壓的治療機制，尤其是通過對Rac1基因的表達來介導(dǎo)PDGF-B、IL-6因子的產(chǎn)生是本研究的新穎點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠，體重（253.8±14.2）g，實驗動物由昆明動物實驗中心提供，合格證號為602023。

1.1.2 器材 大鼠右心導(dǎo)管（大理學(xué)院生理學(xué)教研室），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），熒光定量PCR（Applied Biosystems公司的7700型）。

1.1.3 試劑 野百合堿（上海純優(yōu)生物有限公司，批號：P1014）；匹伐他汀（日本 Kowa Company，Ltd，批號：H20130101）；大鼠PDGF-B抗體（Bia-Swamp公司）；二抗及DBA顯液試劑盒（上?；鶢栴D生物制劑公司）；IL-6 Elisa試劑盒（美國 Rapidbio）；TRIZOL試劑（天根公司）。灌胃液均按每組設(shè)定的匹伐他汀的量用滅菌水稀釋至2 mL。

1.2 動物分組方法及干預(yù) 50只雄性SD大鼠，體重（253.8±14.2）g，隨機均分為5組，分別為空白組、模型組、匹伐他汀預(yù)防組（1 mg/（kg·d））和匹伐他汀高劑量（3 mg/（kg·d））治療組、低劑量（1 mg/（kg·d））治療組〔3〕。除空白組外其余各組均通過皮下注射野百合堿誘導(dǎo)大鼠形成肺動脈高壓〔4〕。其中預(yù)防組自野百合堿皮下注射當日起每日給予匹伐他?。? mg/（kg·d））灌胃至第8周末。匹伐他汀高劑量組（3 mg/（kg·d））和低劑量組（1 mg/（kg·d））在第4周末開始給予匹伐他汀相應(yīng)劑量灌胃至第8周末。模型組和空白組生理鹽水灌胃至第8周末。

1.3 肺動脈壓的測定 用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后，參照孫波等〔5〕方法，血流動力學(xué)測定主要記錄平均肺動脈壓（mPAP），用右心導(dǎo)管及生理記錄儀記錄。

1.4 肺動脈形態(tài)學(xué)觀察 取右中肺約200 mg，經(jīng)石蠟切片、HE染色后，顯微鏡下雙盲閱片，對肺小動脈管壁厚度進行統(tǒng)計學(xué)分析，每張切片均選取3～5個肺小動脈進行測量血管內(nèi)外徑，其差值為血管壁厚度（WT），血管壁厚度百分比=（管壁厚度×2）／外徑×100%，計算其平均值。

1.5 右心室肥厚的判斷 將心臟分離為右心室游離壁（RV）和左心室加室間隔（LV+S），用濾紙吸干后稱其重量，計算RV／（LV+S）比值，判斷右心室的肥厚程度。

1.6 肺組織中血小板源性生長衍生因子-B（PDGFB）免疫組化染色和結(jié)果判斷 取肺組織經(jīng)石蠟切片后經(jīng)免疫組化染色，依次脫蠟、抗原修復(fù)、用過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶、滴加一抗、再滴加二抗、DAB（偶氮變色酸）顯色等步驟。以棕黃色反應(yīng)物為陽性信號，每張切片選取直徑100～150 μm肺小動脈3～5支，染色深淺表示PDGF-B的表達強度。

1.7 RT-PCR法檢測肺組織Rac1的mRNA 引物合成由天根公司完成。Rac 1引物序列：上游5'-CCTGCTCATCAGTTACACGAC-3'，下游 5'-GACGCAG-TCTGTCATAATCTT-3'，擴增片段長度為180 bp。β-actin基因為內(nèi)參照，上游5'-CACCCGCGAGTACAAC CTTC-3'，下游5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，擴增長度片段為244 bp。PCR過程按照說明書上進行，擴增條件如下：①95℃3 min預(yù)變性；②95℃20 s變性，60℃30 s退火延伸，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR分析：分別測定每個樣品Rac1和β-actionmRNA的Ct值，為了減少操作誤差，將每個樣品均作復(fù)孔。Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。采用相對定量方式表示各樣品Rac1的ΔCt。再按照ΔΔCt＝ΔCt目的基因-ΔCt參照基因，計算 2-ΔΔCt。在對PCR反應(yīng)過程中的每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強度進行實時監(jiān)測的過程中，根據(jù)擴增曲線確定Ct值，利用2-ΔΔCt法計算Rac1相對拷貝數(shù)。

1.8 ELISA檢測肺組織中IL-6 取100 mg已凍存的肺組織剪碎，取0.9 mL滅菌水稀釋勻漿后，2 000 r/min離心10 min，取上清50 μL用于檢測，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗重復(fù)檢測3次，使用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般狀況 預(yù)防組、空白組大鼠均存活。空白組大鼠強壯、呼吸平穩(wěn)；模型組、低劑量組、高劑量組大鼠，在腹腔注射野百合堿1周后，3組大鼠較空白組均有不同程度地出現(xiàn)活動減少，食量減少，至第2周末開始出現(xiàn)體重下降，部分大鼠出現(xiàn)喘息，第3周末上述癥狀更嚴重，鼻、唇紫紺，至第4周末時模型組和高劑量組各死亡1只，低劑量組死亡2只；高劑量組、低劑量組在4周末后給予匹伐他汀治療后，大鼠呼吸逐漸平穩(wěn)，體重開始增加，并且高劑量組優(yōu)于低劑量組；至8周末時模型組共死亡6只，高劑量組死亡2只，低劑量組死亡4只，預(yù)防組死亡2只，空白組無死亡。肺動脈高壓形成之后匹伐他汀治療能顯著改善生存率（低劑量組、高劑量組與模型組比較為60%、80%比40%），解剖死亡大鼠，可見胸腔積液、肺部淤點淤斑，且可見右心室游離壁明顯肥厚。

2.2 肺動脈壓的測定和肺小動脈形態(tài)學(xué)、右心室肥厚判定 模型組與空白組相比較，mPAP值、肺小動脈管壁增厚程度及右心室肥厚程度顯著升高（P均＜0.01）；模型組與預(yù)防組、高劑量治療組、低劑量治療組相比較，mPAP值、肺小動脈管壁增厚程度及右心室肥厚程度也升高（P均＜0.01），而預(yù)防組、高劑量治療組、低劑量治療組組間比較上述指標差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1及圖1。由圖1可知模型組大鼠肺小動脈管壁厚度明顯高于其他組。

2.3 肺組織中PDGF-B的表達情況 與模型組比較，高劑量治療組及低劑量治療組、預(yù)防組不同程度地抑制了PDGF-B的基因表達，均明顯低于模型組（P均＜0.01），高劑量治療組及低劑量治療組間上述指標差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1及圖2。由圖2可知模型組大鼠肺小動脈管壁PDGFB明顯高于其他組。

2.4 實時熒光定量PCR檢測及ELISA檢測 結(jié)果顯示，Rac1 mRNA的表達在空白組中較低，預(yù)防組和治療組較高，模型組最高。與模型組比較，各組值明顯降低（P均＜0.01）；IL-6的表達量同樣是模型組最高，與模型組比較，各組值明顯降低（P均＜0.01）。見表1。

表1 實驗各組大鼠各指標的比較（±s，n=10）

表1 實驗各組大鼠各指標的比較（±s，n=10）

注：與模型組比較aP＜0.01，bP＜0.01，cP＜0.01，dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.01；與高劑量組比較gP＜0.05，hP＜0.05，iP＜0.05。其中，l mm Hg=0.133 3 kPa。

指標平均肺動脈壓/mmHg肺小動脈血管壁厚度/%右心室肥厚程度血小板源性生長衍生因子-B表達陽性率/%肺組織Rac1 mRNA表達陽性率/%白介素6/(ng/L)空白組17.32±1.21 18.87±3.12 0.34±0.01 12.92±2.47 0.97±0.12 35.69±3.62預(yù)防組24.20±2.31a 35.37±2.15b 0.37±0.01c 19.30±3.62d 1.57±0.28e 54.38±2.37f高劑量組25.70±2.56a 41.04±3.70b 0.38±0.02c 17.38±2.78d 1.53±0.20e 50.18±4.27f低劑量組28.49±3.39ag 37.28±1.04bh 0.40±0.01ci 24.27±2.63d 1.71±0.11e 65.12±4.86f模型組36.18±4.51 57.01±4.38 0.55±0.02 35.42±4.10 1.96±0.25 87.49±5.28

圖1 大鼠肺小動脈病理切片圖（HE，×400）

圖2 大鼠肺小動脈PDGF-B免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（ISH，×400）

3 討論

PAH是臨床常見的病理生理的過程，常繼發(fā)于心肺等多種疾病，目前對于PAH發(fā)病機制及治療的研究有很大程度的提高〔6〕。隨著細胞和分子水平研究深入，在對肺動脈高壓的發(fā)病機制及病理生理的研究有了較大的突破，新的治療藥物及方法也逐漸增多，其中他汀類的藥物就是其中的一種。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑。大量的研究證實〔7-8〕他汀類藥物具有較多的降脂外作用，包括抗血管平滑肌細胞增殖、抗凋亡作用、抗氧化作用、抑制炎性因子產(chǎn)生等作用。

一方面，他汀類藥物強大的抗炎作用在很多方面已經(jīng)得到證實，但是匹伐他汀的抗炎作用在對肺動脈高壓的治療尚未具體報道。在本實驗設(shè)計構(gòu)思中假設(shè)它有抗炎作用，研究能否通過抗炎作用逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的形成；在通過對大鼠肺組織中的炎癥介質(zhì)IL-6的檢測，結(jié)果證實匹伐他汀可以減少肺組織中IL-6的分泌，從而可以產(chǎn)生抗炎作用，并能在一定程度上逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的發(fā)生。IL-6作為一種炎癥介質(zhì)，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的地位〔9〕。目前，PAH發(fā)生機制雖未明確闡明，但認為IL-6自身可介導(dǎo)肺血管平滑肌免疫和炎性反應(yīng)，并產(chǎn)生大量如C-反應(yīng)蛋白等急性炎性反應(yīng)產(chǎn)物；促進誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶增加，使心肌環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，鈣內(nèi)流減少，最終出現(xiàn)肺動脈彈性減退，所以在肺動脈高壓的進展中，由于各種因素導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起IL-6在肺組織分泌增加，而IL-6又可進一步損害肺動脈，由此形成惡性循環(huán)。

另一方面，有報道證實〔10〕他汀類藥物可以影響血管平滑肌細胞的增殖和遷移，且能有效治療肺動脈高壓。推測可能的機制是與其誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞或血管內(nèi)皮細胞凋亡、抑制靶細胞增殖有關(guān)，但是在肺動脈高壓的進展中，有關(guān)對肺動脈平滑肌細胞增殖的細胞因子暫未具體闡明。在本實驗中，通過對各組大鼠肺組織PDGF-B表達量的測定，結(jié)果表明對已誘導(dǎo)形成肺動脈高壓的大鼠肺組織PDGF-B的表達量較正常大鼠多，由此可以推測得出，PDGF-B的表達增多在一定程度上促進肺動脈平滑肌細胞增殖。并且在使用匹伐他汀干預(yù)治療后，PDGF-B在肺組織中的表達量較模型組少，可以進一步得出匹伐他汀能夠通過抑制PDGF-B的表達而逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的進展。PDGF-B是由巨噬細胞產(chǎn)生，主要促進細胞增殖及平滑肌纖維化〔11〕。所以可以推導(dǎo)，在肺動脈高壓形成過程中，多種因素使肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、巨噬細胞增多，而增加PDGF-B表達，從而使肺動脈增殖。

最后，在肺動脈高壓的進展和匹伐他汀對肺動脈高壓治療中，具體是通過什么基因片段來調(diào)控IL-6和PDGF-B在肺組織中分泌和表達的尚不清楚。通過前期對小G蛋白（GTP激酶）的研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族成員中的GTP激酶（Rho GTP ases）是Ras GTP激酶（Ras GTPase）超家族的一個主要分支，目前在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)有8個亞群，共22種，Rac就是其中的一個亞群，并且Rac1是廣泛表達并且研究最多的亞型〔12〕。有文獻〔13〕表明，各種因素如缺氧引起肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）Rac1激活，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS生成及PASMCs增殖促進肺動脈高壓形成〔14〕。在該實驗中把Rac1與PDGF-B、炎癥介質(zhì)IL-6共同研究旨在進一步闡明肺動脈高壓的進展和匹伐他汀對肺動脈高壓治療的具體機制。

通過實驗結(jié)果中可以推測肺動脈高壓形成及匹伐他汀干預(yù)治療的可能部分機制：在肺動脈高壓發(fā)生的各種致病因素如缺氧誘導(dǎo)肺血管的Rac1激活，進而介導(dǎo)細胞外向細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，引起PDGF-B的表達，促進肺血管增殖及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生如IL-6而發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺血管重塑。另外研究〔15〕表明，缺氧誘導(dǎo)Rac1激活，可介導(dǎo)ROS后誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞NF-kB1激活，而活化的NF-kB1可進一歩激活炎性因子IL-6，而IL-6又能誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞炎性損傷、發(fā)生凋亡。本實驗結(jié)果也與此相符。但是在肺動脈高壓的發(fā)生過程中，具體Rac1對肺組織中IL-6產(chǎn)生及PDGF-B的表達具體怎么調(diào)控，還有待進一步的研究。

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