鄭小婷，李麗

（1.浙江省公安廳物證鑒定中心，浙江杭州310009；2.江門市公安局刑警支隊，廣東江門529000）

以STR復(fù)合擴增檢測為代表的法醫(yī)DNA分型技術(shù)以其靈敏度高、核心序列小、可復(fù)合擴增、方法易于標準化等優(yōu)勢，已經(jīng)成為當前法庭科學DNA檢驗的主要手段，在各國刑事案件偵破和民事案件解決中發(fā)揮了重要的作用。本研究在國內(nèi)外實驗室法醫(yī)STR快速檢驗方法[1]的基礎(chǔ)上，從生物物證DNA免提取擴增檢驗、生物物證DNA快速提取檢驗、生物物證DNA快速擴增、利用新型檢測設(shè)備快速檢測及使用GeneMapper ID-X軟件快速分析5個方面進行歸納。

1 生物物證DNA免提取擴增檢驗

免提取擴增技術(shù)又稱直接PCR或直接擴增技術(shù)，是指將未經(jīng)DNA提取或其他前處理的樣本直接加入PCR反應(yīng)體系并獲得擴增產(chǎn)物[2-3]。直接擴增試劑盒在PCR反應(yīng)液中添加了有效的PCR反應(yīng)抑制劑[4]，由于其對血紅素、鞣酸、腐植酸等抑制物的耐受性更高，因此，只要生物物證在單位體積內(nèi)DNA含量足夠，實驗室就可運用直接擴增法獲得較好的分型。

商品化的直接擴增試劑盒如Powerplex?16 HS系統(tǒng)、Identifiler?Direct PCR擴增試劑盒等均能對血液和煙蒂樣本直接擴增，檢驗成功率可達94%以上[5]。Identifiler?Direct PCR擴增試劑盒還能對肋軟骨進行直接擴增和檢測，方法簡單、快速、穩(wěn)定[6]。由于直接擴增可采用10μL體系，當血斑量較少時，選用直接擴增檢驗可減少DNA損耗、節(jié)省提取步驟，提高分型成功率。有研究[7]表明，直接擴增試劑盒對手套、飲料瓶、吸管等接觸性DNA也能直接擴增，獲得有效分型。

2 生物物證DNA快速提取檢驗

2.1 堿性裂解法堿性裂解法[8]因強堿NaOH能有效消除抑制劑對

Taq酶的抑制，使擴增效果明顯增強。運用堿性裂解法可在5~10min內(nèi)快速提取血斑、唾液斑、精斑、毛發(fā)、新鮮組織等常規(guī)生物物證上的DNA。改良的堿性裂解法[9]，通過調(diào)整NaOH的濃度至0.25mol/L、Tris-HCl的濃度至0.05mol/L及pH值至6.5，可使檢驗結(jié)果均衡性達到最好，且在8min內(nèi)就可完成各類生物物證的DNA提取，尤其適用于毛發(fā)及精斑的檢驗。

2.2 運用脫氧核糖核酸酶

含有精斑的混合斑物證檢驗耗時長，常規(guī)方法在消化女性成分后，需進行多次清洗以清除女性成分，用常規(guī)的Chelex法、硅珠法或磁珠法提取精子也需較長時間。脫氧核糖核酸酶DNaseⅠ可消化單鏈或雙鏈DNA，產(chǎn)生具有3羧基和5′磷酸末端的2-、3-寡核苷酸產(chǎn)物[10]，可以使女性上皮細胞DNA降解但不會破壞精子頭部的DNA。在差異裂解法的同時，應(yīng)用DNaseⅠ將混合斑中的女性DNA分解除去，再結(jié)合堿性裂解法消化精子，可省去清洗步驟，快速獲得精子DNA[11]。

2.3 PrepFiler Express BTA提取試劑盒

高林林等[12]使用PrepFiler Express BTA提取試劑盒（美國AB公司）裂解消化骨粉或牙粉，配合Auto-Mate ExpressTM自動化法醫(yī)DNA提取工作站提取骨骼及牙齒DNA，用少量的檢材（150mg左右）在3h左右就可以完成骨骼及牙齒的DNA提取及純化，該方法檢驗了150年前的清代遺骸，成功獲得常染色體STR分型。該研究證明，利用PrepFiler Express BTA提取試劑盒裂解消化骨粉或牙粉，結(jié)合硅珠法進行手工提取純化，可達同樣快速檢驗的效果。

3 生物物證DNA快速擴增

3.1 使用高效的擴增試劑盒

目前使用常規(guī)提取、擴增、檢測方法進行STR檢驗生物物證至少需要8~10 h，其中最耗時的步驟是PCR擴增。使用特殊處理后的DNA聚合酶和更快的變溫速率已經(jīng)可以使PCR復(fù)合擴增的時間下降至約30min或更短[13-14]。近年來部分商品化擴增試劑盒在擴增時間上較以往試劑盒明顯縮短，如GlobalFiler試劑盒（美國AB公司），利用經(jīng)過優(yōu)化的試劑、熱循環(huán)參數(shù)以及寡核苷酸合成和純化上的最新技術(shù)，使其在80min內(nèi)可完成21個常染色體基因座的復(fù)合擴增。而目前實驗室常用的Identifiler試劑盒，擴增時間需要3h左右。

3.2 調(diào)整擴增參數(shù)

李秋陽等[15]通過調(diào)整GoldeneyeTM20A-M試劑盒的擴增參數(shù)，進一步縮短其PCR擴增時間至40 min左右，通過對濾紙血痕進行批量檢驗，獲得了良好的分型結(jié)果，而建庫樣本保存時間的長短對檢出率的影響不顯著。

3.3 快速擴增設(shè)備

升降溫速率快、溫控性能好的快速PCR儀，如Veriti擴增儀（美國AB公司）、Eppendorf Mastercycler可明顯縮短PCR擴增時間。

4 利用新型檢測設(shè)備快速檢測

在檢測設(shè)備上，目前實驗室普遍配置的3100型或3130XL型遺傳分析儀在45min的時間完成16個樣本的檢測，而新型的3500XL型遺傳分析儀可在35 min的時間內(nèi)完成24個樣本的檢測，有效提高實驗室在大批量生物物證檢驗的工作效率。

5 使用GeneMapper ID-X軟件快速分析

大通量的檢測設(shè)備使物證樣本快速獲得檢測的同時，也帶來大批量的數(shù)據(jù)需要分析，選用好的分析軟件往往使實驗室工作事半功倍。GeneMapper ID-X軟件可以對310、3130XL、3500XL等遺傳分析儀所采集的數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評分。通過軟件運行驗證后，標記為“綠燈”的DNA圖譜通常很好，一般不需要進行人工審查。在建立專案數(shù)據(jù)包后，可從大量的檢材中快速發(fā)現(xiàn)相同分型，并可分析混合分型與單一分型的關(guān)系，為混合分型找到可能的提供者。

在實際檢案工作中，實驗室可根據(jù)檢驗需求靈活使用不同的快速STR檢驗方案，在最短的時間內(nèi)為偵查提供破案線索，鎖定犯罪嫌疑人。

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