孫許朋 ，楊世平 ，武紅艷 ，郭娟寧 ，岳俊濤 ，樊愛英

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.許昌市公安局犯罪偵查支隊，河南 許昌 461000）

Y染色體呈父系遺傳，不易受重組和回復(fù)突變的影響，在涉及性犯罪、追溯父系同代、隔代親權(quán)鑒定等方面具有應(yīng)用價值。本研究對河南漢族人群16個YSNP位點的多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，旨在為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用和群體進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與位點選擇

收集由許昌市公安局犯罪偵查支隊提供的176份河南地區(qū)漢族男性無關(guān)個體血樣。常規(guī)Chelex-100法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)國際Y染色體協(xié)會提出的系統(tǒng)樹[1]，挑選在東亞群體中多態(tài)性較好的16個Y-SNP位點（M9、M89、M95、M119、M122、M214、P136、P148、P164、P191、P196、P197、P198、P199、P200、P201）。 用 Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot微測序引物，由大連寶生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 16個Y-SNP位點的引物序列和SNaPshot微測序引物

1.2 擴(kuò)增

分別對男性DNA樣本的16個Y-SNP位點進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增以驗證其準(zhǔn)確性，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括：1×PCR 緩沖液、200 μmol/L dNTPs、2.0 mmol/L MgCl2、1U AmpliTaq Gold?DNA聚合酶。擴(kuò)增條件：94℃ 11 min；94℃ 60 s，62 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32 個循環(huán)；72℃ 15min。

1.3 SNaPshot微測序

SNaPshot微測序反應(yīng)前取1.5 μL PCR產(chǎn)物，加入0.5 U蝦堿性磷酸酶 1 U/μL，2 U核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ） 10U/μL，置入 2720型擴(kuò)增儀（美國 AB 公司）進(jìn)行反應(yīng)，37℃孵化60min，80℃滅活15min。

SNaPshot微測序采用5μL反應(yīng)體系，內(nèi)含1.5μL SNaPshot反應(yīng)混合液，1.5 μL純化后的PCR產(chǎn)物和1μL單堿基延伸引物。 循環(huán)條件：96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 30s，共25個循環(huán)。向SNaPshot微測序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入1 U蝦堿性磷酸酶 （1 U/μL），37℃孵化60min，80℃變性 15min。

1.4 電泳檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用3130遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper?ID v3.2軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用直接計數(shù)法計算各基因座等位基因頻率及單倍型頻率，基因多樣性（gene diversity，GD）及單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）計算均按公式：GD（HD）=n[1-Σ（Pi）2]/（n-1）[2]。 式中 n 為樣本數(shù)，Pi為基因頻率或單倍型頻率。

2 結(jié)果與討論

對16個Y-SNP位點分別成功進(jìn)行了擴(kuò)增，其片段大小為100～400bp。16個Y-SNP位點在河南漢族群體均呈多態(tài)性分布。其等位基因頻率和單倍型頻率分布及群體遺傳學(xué)參數(shù)詳見表2～3。

表2 河南漢族群體16個Y-SNP位點的基因頻率和基因多樣性 （n=176）

表3 河南漢族群體18種單倍型頻率分布 （n=176）

本研究16個Y-SNP位點多態(tài)性分布較好，GD為0.1104～0.5016，M95的GD值最低。由于Y染色體上的遺傳標(biāo)記存在連鎖，故實際檢出的單倍型數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論上可能組合的數(shù)量。本研究在176個男性個體中共檢出18種單倍型，其中頻率最高的為0.1420，頻率最低的僅0.0114。HD達(dá)到0.9248，具有較高的個體識別率和非父排除率，在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有較高的價值，同時也可作為Y-STR標(biāo)記的有效補(bǔ)充。為今后進(jìn)一步在增加樣本量及Y-SNP位點數(shù)基礎(chǔ)上研究中國人群的遺傳結(jié)構(gòu)特征及群體間的相互關(guān)系提供了寶貴的遺傳資料。