顏 博， 李國良

(中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410008)

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miR-133a/b和MRP1在耐藥性癲癇患者外周血含量的觀察

顏 博， 李國良△

(中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410008)

目的： 探討外周血中microRNA-133a/b(miR-133a/b)及多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)的含量與癲癇患者耐藥性的相關(guān)關(guān)系。方法: 生物信息學(xué)預(yù)測靶向調(diào)控MRP1的miRNAs，構(gòu)建MRP1野生型及突變型3’UTR報告基因載體，雙螢光素酶報告基因技術(shù)驗證預(yù)測的miRNAs對MRP1的靶向調(diào)控作用。此外，收集95例接受藥物治療的癲癇患者(其中耐藥患者37例，非耐藥患者58例)外周血，實時熒光定量PCR檢測外周血中這些miRNAs的含量，ELISA檢測外周血中MRP1蛋白的含量。最后分析這些miRNAs及MRP1含量與癲癇耐藥的相關(guān)性。結(jié)果: TargetScan軟件預(yù)測miR-133a/b可能靶向調(diào)控MRP1，雙螢光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，實驗組(共轉(zhuǎn)入miR-133a/b mimics、pMIR-MRP1及pRLTK質(zhì)粒)較對照組(共轉(zhuǎn)入scramble mimic、pMIR-MRP1及pRLTK質(zhì)粒)相比，螢光素酶活性分別下調(diào)76.9%和64.1%(P<0.01)；突變組(共轉(zhuǎn)入miR-133a/b mimics、pMIR-mut-MRP1及pRLTK質(zhì)粒)較實驗組的螢光素酶活性分別上調(diào)3.61倍和2.04倍(P<0.01)。實時熒光定量PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：用藥前非耐藥性癲癇患者中miR-133a/b的含量分別是耐藥性癲癇患者含量的2.18倍和1.74倍(P<0.05)，而MRP1在耐藥性癲癇患者中的含量是非耐藥性癲癇患者中的3.72倍(P<0.01)；用藥后非耐藥性癲癇患者中miR-133a/b的含量分別是耐藥性癲癇患者含量的2.76倍和2.95倍(P<0.05)，而MRP1在耐藥性癲癇患者中的含量是非耐藥性癲癇患者中4.99倍(P<0.01)。結(jié)論: miR-133a/b可直接靶向調(diào)控MRP1，且在耐藥性癲癇患者血清中，miR-133a/b呈現(xiàn)低水平，MRP1蛋白呈現(xiàn)高水平，miR-133a/b聯(lián)合MRP1有望成為早期診斷癲癇藥物敏感性的指標(biāo)。

MicroRNA-133a/b； 多藥耐藥相關(guān)蛋白1； 耐藥性癲癇

因大腦神經(jīng)元反復(fù)異常同步化放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常稱之為癲癇，它是一種慢性腦部疾病。2011年WHO報告指出全球癲癇患者人數(shù)達(dá)到5 000萬，其中90%的患者來自發(fā)展中國家。目前該疾病的治療主要包括藥物治療、心理治療、物理治療和手術(shù)治療等多種方法。雖然市面上癲癇藥物種類繁多，但是其治療均無法達(dá)到滿意的療效，仍有30%的癲癇患者發(fā)展為耐藥性癲癇[1]。臨床上將經(jīng)過單獨或聯(lián)合使用抗癲癇藥物治療后，血藥濃度在有效范圍內(nèi)或已達(dá)最大劑量，仍不能有效控制癲癇發(fā)作，且影響日常生活的癲癇疾病稱之為耐藥性癲癇，又為難治性癲癇[2]。

MicroRNA(miRNA)是一類長約22 nt的非編碼RNA，它們介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)血清中可以檢測到miRNAs，且它們的水平因疾病而異[4]。多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resis-tance-associated protein 1, MRP1)屬于ABC轉(zhuǎn)運載體蛋白家族，具有廣泛的生物學(xué)功能。目前已有許多文獻(xiàn)報道，該基因的表達(dá)與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[5-6]。有跡象表明MRP1可能參與耐藥性癲癇的發(fā)生。本課題擬從此出發(fā)，生物信息學(xué)預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)控MRP1的miRNAs，體外驗證該miRNAs對MRP1的靶向調(diào)控作用，并在患者血清中檢測該miRNAs及MRP1的表達(dá)量，探討其在癲癇耐藥中的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 研究對象及血清收集

參與本課題耐藥組癲癇患者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：目前比較認(rèn)可的耐藥性癲癇定義是指患者正確使用2種或者3種以上抗癲癇藥物(具有足夠的療程及劑量治療的情況下)后，仍無法控制癲癇(即：癲癇無發(fā)作少于3倍治療前最長發(fā)作間隔或無發(fā)作短于12個月)。非耐藥組納入標(biāo)準(zhǔn)：使用抗癲癇藥物前3個月發(fā)作次數(shù)大于3次，采用一種抗癲癇藥物，持續(xù)6個月以上無發(fā)作。排除標(biāo)準(zhǔn)：有遺傳代謝病、顱內(nèi)占位性疾病、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全和未規(guī)律服藥等病史患者。收集2012年1月～2014年9月來本院就診的癲癇患者95例血標(biāo)本。男43例，女52例，年齡3個月至82歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得各研究對象監(jiān)護(hù)人的知情同意。

將采集到的患者全血標(biāo)本于室溫放置2 h或4 ℃過夜，1 000×g離心20 min，取上清并分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑及細(xì)胞培養(yǎng)

RPMI-1640、胎牛血清、胰酶購自Gibco；miR-133a/b mimics及scramble mimic購自廣州銳博生物有限公司；HindⅢ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermentas；miRNeasy Mini Kit購自Qiagen；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；Dual-Luciferase Reporter Gene Assay System購自Promega；MRP1 ELISA試劑盒購自江萊生物有限公司；All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit、All-in-One miRNA qPCR Primer購自廣州富能基因有限公司。

293T細(xì)胞由本科室保存，將其接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d換1次液，生長到 80%時傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實驗對象。

3 實驗方法

3.1 載體構(gòu)建 載體pMIR-REPORT及pRLTK質(zhì)粒由本室保存。利用在線軟件TargetScan預(yù)測到miR-133a/b轉(zhuǎn)錄調(diào)控MRP1基因。將含有miR-133a/b結(jié)合位點的野生型及突變型MRP1 3’UTR序列送至Invitrogen合成(表1)。HindⅢ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶于37 ℃消化pMIR-REPORT載體3 h，將合成好的片段重組到該載體，測序鑒定陽性報告基因載體，并將其命名為pMIR-MRP1和pMIR-mut-MRP1。

3.2 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?提前24 h將293T細(xì)胞種于96孔板(密度為每孔5 000個)，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miRNA mimics 與相應(yīng)的報告基因載體及內(nèi)參pRLTK共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞。48 h后，每孔加入25 μL 1×passive lysis buffer，室溫裂解20 min，每孔吸取20 μL上述裂解液于對應(yīng)白板中，每孔加入50 μL luciferase assay reagent Ⅱ，多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲螢光素酶活性；之后每孔繼續(xù)加入50 μL stop & Glo，多功能酶標(biāo)儀檢測海腎螢光素酶活性。用螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性即為該孔的螢光素酶活性。實驗重復(fù)3次確?？煽啃浴?/p>

表1 引物列表

F:forward; R:reverse. Capital letters are restriction sites; shaded areas represent the binding site of miR-133a/b; italic and shaded areas denote the mutant binding site of miR-133a/b.

3.3 血清miRNAs的提取與逆轉(zhuǎn)錄 吸取200 μL血清，加入700 μL QIAzol Lysis Reagent，室溫靜置5 min，加入140 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min，12 000×g、4 ℃離心15 min。吸上清至新的離心管，加入525 μL無水乙醇，上、下顛倒混勻。加入700 μL上述液體于回收柱中，10 000×g離心15 s。棄廢液，柱中加入DNase I消化DNA 15 min，加入700 μL buffer RWT，10 000×g離心15 s。棄廢液，500 μL Buffer RPE洗滌柱子2次，15 000×g離心1 min。將柱子放入新的1.5 mL EP管中，加入30 μL RNase-free water，室溫靜置2 min，12 000×g離心1 min。-80 ℃保存miRNAs。逆轉(zhuǎn)錄體系如下：miRNAs 2 μg，PolyA polymerase 1 μL，RTase Mix 1 μL，5× reaction buffer 5 μL，并用RNase-free water補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。-20 ℃保存該cDNA。

3.4 實時熒光定量PCR 根據(jù)All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit配置如下的反應(yīng)體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，All-in-One miRNA qPCR Primer 2 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，cDNA 2 μL，用RNase-free water補(bǔ)足體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s(40個循環(huán))。實驗重復(fù)3次確保可靠性。

3.5 ELISA實驗 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1 600、800、400、200、100、50 ng/L。將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本分別加入到預(yù)先包被人MRP1單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，37 ℃溫育30 min，棄廢液，吸水紙上拍干，每孔加200 μL洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，洗滌4次。每孔加入酶標(biāo)工作液50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌4次。每孔加入顯色劑A 液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，輕輕振蕩混勻30 s，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。多功能酶標(biāo)儀450 nm波長處測量各孔的吸光度(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的A值，計算樣本中人MRP1含量。實驗重復(fù)3次確保可靠性。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行配對樣本t檢驗或獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-133a/b轉(zhuǎn)錄調(diào)控MRP1

通過在線軟件TargetScan，預(yù)測miR-133a/b轉(zhuǎn)錄調(diào)控MRP1(圖1A)，將MRP1 3’UTR 種子序列及其突變種子序列分別重組到pMIR-REPORT載體中，雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-133a/b較對照組螢光素酶活性下調(diào)(P<0.01)；而與miR-133a/b結(jié)合位點突變組則較非突變組的螢光素酶活性上調(diào)(P<0.01)，見圖1B。根據(jù)上述結(jié)果，我們確定MRP1就是miR-133a/b的靶基因。

2 癲癇患者用藥前后血清中miR-133a/b及MRP1含量的比較

納入研究的95例癲癇患者中有37例是耐藥性癲癇患者，58例非耐藥性癲癇患者。用實時熒光定量PCR和ELISA技術(shù)分別檢測癲癇患者血清中miR-133a/b及MRP1的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用藥前非耐藥性癲癇患者miR-133a及miR-133b的含量分別是耐藥性癲癇患者含量的2.18倍和1.74倍(P<0.05)，而MRP1在耐藥性癲癇患者的含量是非耐藥性癲癇患者的3.72倍(P<0.01)；用藥后非耐藥性癲癇患者中miR-133a及miR-133b的含量分別是耐藥性癲癇患者表達(dá)量的2.76倍和2.95倍(P<0.05)，而MRP1在耐藥性癲癇患者中的含量是非耐藥性癲癇患者的4.99倍(P<0.01)；耐藥性癲癇患者用藥前miR-133a及miR-133b的含量分別是用藥后含量的1.52倍和1.57倍(P<0.05)，而耐藥性癲癇患者的MRP1含量是非耐藥性癲癇患者的1.50倍(P<0.05)；非耐藥性患者血清的miR-133a/b及MRP1含量在用藥前后沒有顯著差異，見表2。

Figure 1.miR-133a/b directly targetsMRP1. A: potential miRNA regulators ofMRP1 were predicted using public database TargetScan; B: miR-133a/b transcriptionally regulatedMRP1invitrodetected by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble;##P<0.01vspMIR-MRP1.

圖1 miR-133a/b轉(zhuǎn)錄調(diào)控MRP1

討 論

癲癇因病程較長、致殘率極高且反復(fù)發(fā)作等因素嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。而耐藥性癲癇的出現(xiàn)成為治療癲癇的重要瓶頸，是亟需解決的重大課題。

MRP1基因位于人16號染色體長臂13.1帶，其mRNA長度為7.8～8.2 kb。在血管星形細(xì)胞中過表達(dá)MRP1或者其它ABC家族蛋白，能夠?qū)⒖拱d癇藥物泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞對藥物發(fā)生耐受[7-8]。邵淑麗等[8]通過siRNA技術(shù)敲低MRP1基因表達(dá)成功地逆轉(zhuǎn)錄肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性。 有學(xué)者報道在海馬硬化的耐藥性癲癇患者切除灶中檢測MRP1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均明顯高于對照組[9-10]。陳英輝等[11]通過RT-PCR、Western blotting及免疫組化等方法，對20例耐藥性癲癇患者癲癇切除灶進(jìn)行研究，證實了耐藥性癲癇患者腦內(nèi)MRP1的表達(dá)顯著高于正常對照組。我們使用ELISA方法也獲得了一致的結(jié)果，用藥前MRP1在耐藥性癲癇患者血清中的含量是非耐藥性癲癇患者的3.72倍，用藥后MRP1在耐藥性癲癇患者血清中的含量是非耐藥性癲癇患者的4.99倍，說明MRP1在耐藥性癲癇患者血清中的含量遠(yuǎn)高于非耐藥癲癇患者，且具有顯著差異。

表2 用藥前后不同類型癲癇患者血清中miR-133a/b和MRP1含量的變化

Table 2.The serum levels of miR-133a/b and MRP1 in the epilepsy patients with or without drug resistance before and after administration (Mean±SD)

AdministrationEpilepsypatientsnmiR-133amiR-133bMPP1(ng/L)BeforeNonresistant582.40±0.482.03±0.93292.57±22.45 Drug-refractory371.10±0.39*1.17±0.18*1088.36±45.71**AfterNonresistant581.87±0.321.72±0.15300.89±31.06 Drug-refractory370.68±0.01*#0.58±0.05**#1501.44±122.01**#

*P<0.05,**P<0.01vsnonresistant;#P<0.05vsbefore administration.

多項研究指出血清中miRNAs的表達(dá)特征可作為疾病診斷和預(yù)防的生物標(biāo)志物，具有巨大潛力[12-13]。應(yīng)夢佳等[14]在LS174T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-328和miR-206可以抑制MRP3和MRP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。肖慧媚等[15]用Hiseq測序法對耐藥性癲癇患兒及非耐藥性癲癇患兒血清的miRNA測序，并用RT-PCR驗證其差異性表達(dá)的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患兒血清中miR-146a-5p和miR-23a-3p的含量較非耐藥性癲癇患兒血清中的含量顯著增高。我們利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并用雙螢光素酶報告基因驗證，發(fā)現(xiàn)miR-133a/b靶向調(diào)控MRP1。采用實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)miR-133a/b在耐藥性癲癇患者血清中的含量遠(yuǎn)低于在非耐藥性癲癇患者中的含量，與MRP1的含量呈負(fù)相關(guān)。這提示miR-133a/b及MRP1可聯(lián)合使用，有望成為早期診斷耐藥性癲癇的分子標(biāo)志物，有利于早期選擇合適的治療方案，提高患者的治療效果。

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Levels of miR-133a/b and MRP1 in peripheral blood of patients with drug-refractory epilepsy

YAN Bo, LI Guo-liang

(DepartmentofNeurology,AffiliatedXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410008,China.E-mail:tvtvtv06@qq.com)

AIM: To investigate the levels and clinical significance of microRNA-133a/b (miR-133a/b) and multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) in peripheral blood of the patients with drug-refractory epilepsy. METHODS: Prediction of the miRNAs targeting transcriptional regulation ofMRP1 was conducted by bioinformatics analysis. The plasmids containing wild type and mutant 3’UTR ofMRP1 reporter gene were constructed. Dual luciferase reporter gene assay was used to verify this prediction. In addition, the peripheral blood samples of the epilepsy patients (37 cases were drug-refractory, the other 58 cases were nonresistant) were collected. The levels of miR-133a/b and MRP1 were measured by real-time PCR and ELISA. RESULTS: Through TargetScan database, it was predicted that miR-133a/b transcriptionally regulatedMRP1. The results of dual luciferase report gene assay suggested that luciferase activity in experimental group with miR-133a/b mimics, pMIR-MRP1 and pRLTK plasmids were down-regulated by 76.9% and 64.1% compared with that in control group with scramble mimic, pMIR-MRP1 and pRLTK plasmids. The luciferase activity was up-regulated by 3.62 times and 2.04 times in mutation group with miR-133a/b mimics, pMIR-mut-MRP1 and pRLTK plasmids compared with experimental group. Before administration, the serum levels of miR-133a/b in the epilepsy patients without drug resistance was 2.18 times and 1.74 times higher than than in the epilepsy patients with drug resistance (P<0.05), respectively, while MRP1 expression level was 3.72 times higher in the epilepsy patients with drug resistance than those in the epilepsy patients without drug resistance. After administration, the levels of miR-133a/b in the epilepsy patients without drug resistance were 2.76 times and 2.95 times higher than those in the epilepsy patients with drug resistance (P<0.05), respectively, while the serum level of MRP1 in the epilepsy patients with drug resistance was 4.99 times higher than that in the epileptic patients without drug resistance (P<0.01). CONCLUSION: miR-133a/b transcriptio-nally regulatesMRP1. There are lower expression levels of miR-133a/b and higher expression level of MRP1 in the epilepsy patients with drug resistance compared with those in the epilepsy patients without drug resistance. miR-133a/b and MRP1 may be a diagnostic indicator for determining refractory epilepsy.

MicroRNA-133a/b; Multidrug resistance-associated protein 1; Refractory epilepsy

1000- 4718(2015)04- 0680- 05

2014- 11- 19

2014- 12- 09

R742.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.019

△通訊作者 Tel: 0731-84327236; E-mail: tvtvtv06@qq.com