王來亮， 羅 群， 蔡珂丹， 周芳芳， 高燕紅

(寧波市第二醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 寧波 315010)

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帕立骨化醇抑制糖尿病腎病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化*

王來亮， 羅 群△， 蔡珂丹， 周芳芳， 高燕紅

(寧波市第二醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 寧波 315010)

目的： 探討帕立骨化醇(paricalcitol,P)對糖尿病腎病(DN)腎小管間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及可能機(jī)制。方法: 大鼠禁食后，采用單次無菌腹腔注射鏈脲佐菌素建立DN模型。將DN大鼠隨機(jī)分為：(1) 帕立骨化醇干預(yù)組(P組)：帕立骨化醇溶于丙二醇中，于造模成功后第2天以0.4 μg/kg的劑量腹腔注射，每周3次；(2) 糖尿病腎病組(D組)：給予等體積的丙二醇腹腔注射。設(shè)置正常對照組(C組)。帕立骨化醇連續(xù)干預(yù)12周后，測血、尿生化指標(biāo)；進(jìn)行腎臟病理學(xué)檢查；利用免疫組化及Western blotting檢測腎組織TGF-β1、Wnt-4、β-catenin及Klotho蛋白的表達(dá)；并進(jìn)行指標(biāo)間的相關(guān)分析。結(jié)果: (1) 與C組比較，D組大鼠SCr、BUN及24 h尿蛋白水平均升高，而P組均較D組降低(P<0.05)。(2) 與C組比較，D組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化面積增加，而P組較D組減小(P<0.05)。(3) D組大鼠腎組織Klotho蛋白表達(dá)低于C組，而P組高于D組(P<0.05)；與C組比較，D組大鼠腎組織TGF-β1、Wnt-4及β-catenin蛋白表達(dá)增加，而P組表達(dá)均較D組減少(P<0.05)。(4) Klotho與纖維化面積、TGF-β1、Wnt-4及β-catenin均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: 帕立骨化醇可抑制DN大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，其作用可能與增加腎組織Klotho表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號通路激活，同時(shí)減少TGF-β1合成相關(guān)。

帕立骨化醇； 糖尿病腎??； 腎小管間質(zhì)纖維化； Wnt/β-catenin信號通路； Klotho蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的微血管病變，在我國已迅速上升為終末期腎病的重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，DN腎小管間質(zhì)改變并非繼發(fā)于腎小球的病變，而是早期病變及原始特征之一，對腎功能的預(yù)后較腎小球病變更為重要[1-2]。帕立骨化醇(paricalcitol,P)為新型的維生素D類似物，對腎臟具有多方面的保護(hù)作用[3-4]，但其對DN腎小管間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制尚未闡明。本研究利用帕立骨化醇作用于DN大鼠，通過觀察腎組織病理學(xué)改變及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)蛋白、Wnt/β-catenin信號途徑與Klotho蛋白表達(dá)的變化，以探討帕立骨化醇對腎小管間質(zhì)纖維化的作用及可能機(jī)制，最終為DN腎小管間質(zhì)纖維化的防治提供新靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑

雄性Sprague Dawley大鼠24只，清潔級封閉群，體重200～220 g，由浙江省動物中心提供，于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。兔抗Klotho多克隆抗體(Prosci)；兔抗β-catenin多克隆抗體(Gene Tex)；兔抗Wnt-4多克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體及兔抗β-actin多克隆抗體(Santa Cruz)；山羊抗兔IgG熒光II抗(Odyssey)；鏈脲佐菌素(Sigma)；帕立骨化醇(Abbott)；免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)。

2 動物模型的建立與分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12 h后單次無菌腹腔注射1%鏈脲佐菌素(65 mg/kg)。1%鏈脲佐菌素溶液臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸二鈉緩沖液(pH4.5)配制，30 min內(nèi)注射完。72 h后夜間禁食(≥8 h)，晨起斷尾取血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L并能維持1周者確定為糖尿病模型；3周后測尿蛋白≥30 mg/24 h者確定為糖尿病腎病造模成功。16只大鼠糖尿病腎病造模全部成功。將糖尿病腎病大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組8只：(1) 帕立骨化醇干預(yù)組(P組)：帕立骨化醇溶于丙二醇中，于造模成功后第2 天以0.4 μg/kg的劑量腹腔注射，每周3次，連續(xù)12周；(2) 糖尿病腎病組(D組)：DN大鼠給予等體積的丙二醇腹腔注射。另設(shè)正常對照(control,C)組：正常大鼠給予等體積的丙二醇腹腔注射。

3 標(biāo)本收集

連續(xù)干預(yù)12周后大鼠禁食，代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量后留取樣品5 mL，2 000 r/min離心10 min，取上清待檢。用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后處死大鼠，心臟采血3～5 mL，3 500 r/min離心10 min，留取血清待檢。采血后立即開腹取雙腎，清除腎蒂結(jié)締組織及腎臟包膜，縱向剖開腎臟：取部分組織置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋；其余腎組織用液氮凍存。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 生化指標(biāo)檢測 血糖采用快速血糖儀檢測；血清肌酐、血尿素氮、尿蛋白、血鈣磷及全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone，iPTH)采用Beckcoulter UniCel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀檢測。

4.2 腎臟病理學(xué)檢查 腎組織石蠟切片(厚3～4 μm)，進(jìn)行常規(guī)HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)行半定量分析：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)視野(×200)，分別檢測每個(gè)視野中腎小管間質(zhì)纖維化的特異染色面積，用平均染色面積作為組織纖維化的替代指標(biāo)。

4.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 腎組織石蠟切片(厚3～4 μm)，脫蠟、水化，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，5% BSA封閉；分別滴加Klotho(1∶300)、Wnt-4(1∶200)、β-catenin(1∶200)和TGF-β1(1∶100)I抗，4 ℃孵育過夜；滴加HRP標(biāo)記的II抗，顯微鏡下控制DAB顯色；蘇木素復(fù)染，脫水、透明并封片。用PBS替代I抗作陰性對照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)視野(×200)，分別檢測每個(gè)視野中指標(biāo)的陽性區(qū)積分光密度(integral optical density，IOD)，并取IOD均值作為陽性物質(zhì)的相對表達(dá)量。

4.4 Western blotting實(shí)驗(yàn) 取液氮凍存的腎組織，加適量裂解液后充分研磨，4 ℃裂解組織，12 000×g低溫離心2 min，取上清液，BCA 法測蛋白濃度；取總蛋白30 μg，100 ℃加熱變性5 min后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；5% BSA室溫封閉2 h，加入Klotho(1∶400)、Wnt-4(1∶200)、β-catenin(1∶200)和TGF-β1(1∶200) I抗，4 ℃孵育過夜；加熒光標(biāo)記的II抗(1∶10 000)室溫反應(yīng)1 h后，采用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像，并測量條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行定量分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料應(yīng)用Stata 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)分析采用Pearson’s直線相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生化指標(biāo)

DN第12周，D組的空腹血糖水平顯著高于C組(P<0.05)，但與P組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D組的Scr、BUN及24 h尿蛋白水平均高于C組，但P組均低于D組(P<0.05)；與C組比較，D組的血磷與iPTH水平均上升，血鈣水平下降，但相較于D組，P組的血磷與iPTH水平均回降，血鈣水平回升(P<0.05)，見表1。

表1 各組生化指標(biāo)情況

*P<0.05vsgroup C；#P<0.05vsgroup D.

2 HE染色與Masson染色觀察腎組織的病理改變

C組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，無明顯病理改變；D組可見腎小管間質(zhì)局部炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞脫落，小管擴(kuò)張，基底膜斷裂，與C組比較，纖維化面積(綠色)增大(P<0.05)，P組腎小管間質(zhì)病理改變較D組減輕，纖維化面積減小(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of the renal tissues. A: the pathological images of the renal tissues with HE staining and Masson staining (×200); B: the quantitative analysis of the fibrosis area in the renal tissues. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C；#P<0.05vsgroup D.

圖1 腎組織HE與Masson染色結(jié)果

3 各組腎組織TGF-β1蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，與C組比較，D組腎小管間質(zhì)TGF-β1表達(dá)上調(diào)，積分光密度升高(P<0.05)；而P組TGF-β1表達(dá)較D組下調(diào)，積分光密度降低(P<0.05)，見圖2。Western blotting結(jié)果也顯示，與C組比較，D組腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)增加，而P組較D組表達(dá)減少(P<0.05),見圖3。

Figure 2.The expression of TGF-β1 in the renal tissues determined by immunohistochemical staining (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D.

圖2 免疫組化檢測腎組織TGF-β1的表達(dá)情況

4 各組腎組織Wnt-4及β-catenin蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，與C組比較，D組腎小管間質(zhì)Wnt-4與β-catenin表達(dá)上調(diào)，積分光密度升高(P<0.05)，而P組表達(dá)較D組下調(diào)，積分光密度降低(P<0.05)，見圖4。Western blotting結(jié)果也顯示，與C組比較，D組腎組織Wnt-4與β-catenin蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而P組較D組表達(dá)減少(P<0.05),見圖5。

5 各組腎組織Klotho蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，C組Klotho蛋白在腎小管呈高表達(dá)，與C組比較，D組腎小管Klotho蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；而P組Klotho蛋白表達(dá)較D組上調(diào)(P<0.05)，見圖6。Western blotting結(jié)果同樣顯示，與C組比較，D組腎組織Klotho蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，而P組較D組表達(dá)增加(P<0.05)，見圖7。

Figure 3.The expression of TGF-β1 in renal tissue determined by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D.

圖3 Western blotting檢測腎組織TGF-β1的表達(dá)情況

Figure 4.The expression of Wnt-4 and β-catenin in the renal tissues determined by immunohistochemical staining (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C；#P<0.05vsgroup D.

圖4 免疫組化檢測腎組織Wnt-4與β-catenin的表達(dá)情況

Figure 5.The expression of Wnt-4 and β-catenin in the renal tissue determined by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C；#P<0.05vsgroup D.

圖5 Western blotting檢測腎組織Wnt-4與β-catenin的表達(dá)情況

Figure 6.The expression of Klotho protein in the renal tissues determined by immunohistochemical staining (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D.

圖6 免疫組化檢測腎組織Klotho蛋白的表達(dá)情況

6 指標(biāo)相關(guān)性分析

Klotho與纖維化面積、TGF-β1、Wnt-4及β-catenin均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

討 論

Wnt/β-catenin信號通路參與DN腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及腎臟纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，高糖激活腎小管上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路[5-6]，引起β-catenin在胞漿及核內(nèi)聚積，誘導(dǎo)下游基因(Snail、Twist等)的表達(dá)，從而促使小管EMT的發(fā)生[6]。腎小管EMT是小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制[7-9]。值得注意的是，Wnt蛋白受體單克隆抗體或β-catenin、Snail抑制劑均能逆轉(zhuǎn)腎小管EMT[5,10]。Wnt-4為Wnt家族的重要一員，主要由腎臟小管間質(zhì)的成纖維細(xì)胞表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-4在腎小管間質(zhì)纖維化時(shí)表達(dá)明顯增加，使β-catenin在肌成纖維細(xì)胞胞漿聚積，同時(shí)影響小管上皮的結(jié)構(gòu)和功能[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DN大鼠腎組織Wnt-4與β-catenin蛋白表達(dá)增加，均高于正常對照組；而經(jīng)帕立骨化醇干預(yù)，腎組織Wnt-4與β-catenin蛋白表達(dá)減少；提示帕立骨化醇可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的激活，參與DN腎小管EMT介導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化。

Figure 7.The expression of Klotho protein in the renal tissues determined by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D.

圖7 Western blotting檢測腎組織Klotho蛋白的表達(dá)情況

TGF-β1在纖維化腎組織呈高表達(dá)，可激活Wnt/β-catenin信號通路，介導(dǎo)腎小管EMT及腎臟纖維化。研究顯示，TGF-β可通過p38依賴途徑直接激活Wnt/β-catenin信號通路，并下調(diào)Wnt受體拮抗劑DKK-1的表達(dá)水平[12]。此外，DN中Wnt/β-catenin信號通路與TGF-β信號途徑存在交聯(lián)作用，而β-catenin可能是信號交聯(lián)的重要樞紐。研究表明，抑制Wnt下游基因β-catenin可阻斷高糖誘導(dǎo)的近端腎小管EMT[10]，其中機(jī)制可能與β-catenin作為Smad的輔助因子[13]，同時(shí)調(diào)控Wnt/β-catenin與TGF-β/Smad信號通路相關(guān)。因此，靶向調(diào)控β-catenin表達(dá)可能成為治療DN腎小管間質(zhì)纖維化的重要途徑。已有研究證實(shí)，PPAR-γ激動劑可減少β-catenin的表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，通過對TGF-β與Wnt信號通路下游交聯(lián)蛋白β-catenin的調(diào)控，成為帕立骨化醇抑制DN腎小管間質(zhì)纖維化的另一重要機(jī)制。

Klotho基因發(fā)現(xiàn)于1997年，為一種新型抗衰老基因，功能缺陷可導(dǎo)致衰老綜合征。慢性腎臟病早期即可出現(xiàn)Klotho缺乏[14]。Klotho缺乏與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻動物模型中，腎臟Klotho缺乏可加重腎小管間質(zhì)纖維化，TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白及纖連蛋白表達(dá)明顯增加，而補(bǔ)充外源性Klotho可抑制此過程[15]。這可能與Klotho直接結(jié)合TGF-β1 II型受體從而抑制TGF-β1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[15-16]。TGF-β1除了受Klotho水平調(diào)控外，本身也可抑制Klotho的表達(dá)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DN腎組織Klotho蛋白表達(dá)明顯降低，同時(shí)伴TGF-β1蛋白表達(dá)增加；而予帕立骨化醇干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)此結(jié)果,提示帕立骨化醇可通過促進(jìn)腎組織Klotho的表達(dá)，抑制TGF-β1蛋白的合成，從而阻斷DN腎小管間質(zhì)纖維化。

此外，Klotho為Wnt信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子[17-18]，其抗腎臟纖維化作用與調(diào)控Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)緊密相關(guān)。Satoh等[19]研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻小鼠中Klotho低表達(dá)可引起腎組織Wnt信號通路激活，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。Zhou等[17]在單側(cè)輸尿管梗阻與阿霉素腎病小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，在腎組織中Klotho水平與Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DN腎組織Klotho表達(dá)下降伴Wnt-4及β-catenin水平的升高，而帕立骨化醇可逆轉(zhuǎn)Klotho、Wnt-4及β-catenin的表達(dá)?？梢姡ㄟ^促進(jìn)腎小管Klotho的表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路激活，為帕立骨化醇阻斷DN腎小管間質(zhì)纖維化內(nèi)在機(jī)制之一。

總之，糖尿病腎病中Klotho、Wnt/β-catenin信號通路及TGF-β信號途徑相互調(diào)控，其中Klotho缺乏介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路激活及TGF-β1表達(dá)增加，是調(diào)控腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。帕立骨化醇可通過促進(jìn)腎組織Klotho表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號通路激活及TGF-β1蛋白合成，從而阻斷腎小管間質(zhì)纖維化。但目前帕立骨化醇對腎臟Klotho表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，仍需進(jìn)一步研究。

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Influence of paricalcitol on renal tubulointerstitial fibrosis in diabetic nephropathy

WANG Lai-liang, LUO Qun, CAI Ke-dan, ZHOU Fang-fang, GAO Yan-hong

(DepartmentofNephrology,NingboNo. 2Hospital,Ningbo315010,China.E-mail:nbluoqun@163.com)

AIM: To investigate the effect of paricalcitol (P) on renal tubulointerstitial fibrosis and the underlying mechanisms in diabetic nephropathy (DN). METHODS: DN rat model was induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin after fasting. The animals were randomly divided into 2 groups: the DN rats in paricalcitol-intervened group (group P) were injected intraperitoneally with paricalcitol dissolved in propylene glycol after the day when the model was induced successfully at a dose of 0.4 μg/kg (3 times a week); the DN rats in DN group (group D) were given isopyknic propylene glycol. Normal control group (group C) was also set up. The samples of blood, urine and renal tissue were collected after intervention of paricalcitol for 12 weeks. The biochemical indexes were measured. The renal tissues were used for pathologic observation and determining the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), Wnt-4, β-catenin and Klotho by immunohistochemistry and Western blotting. In addition, the correlation among the above indexes was analyzed. RESULTS: (1) Scr, BUN and 24 h urine protein increased significantly in group D compared with group C, while decreased in group P compared with group D (P<0.05). (2) The area of renal tubulointerstitial fibrosis increased in group D compared with group C, while decreased in group P compared with group D (P<0.05). (3) The expression of Klotho decreased, while the expression of TGF-β1, Wnt-4 and β-catenin increased in group D compared with group C (P<0.05). Compared with group D, the expression of Klotho increased, while the expression of TGF-β1, Wnt-4 and β-catenin decreased in group P (P<0.05). (4) The expression of Klotho was negatively correlated with the fibrosis area, TGF-β1, Wnt-4 and β-catenin (P<0.05). CONCLUSION: Paricalcitol inhibits renal tubulointerstitial fibrosis in DN by promoting the expression of renal Klotho, and inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway activation and TGF-β1 synthesis.

Paricalcitol; Diabetic nephropathy; Renal tubulointerstitial fibrosis; Wnt/β-catenin signaling pathway; Klotho protein

1000- 4718(2015)04- 0719- 06

2014- 11- 10

2015- 01- 14

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項(xiàng)目(No. 2012KYB175)；寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A610245)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.026

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