岳喜磊, 成 瑩, 許繼德, 鐘長(zhǎng)江, 楊春濤， 汪 鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510182)

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TRPC1在TGF-β1誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

岳喜磊▲, 成 瑩▲, 許繼德△, 鐘長(zhǎng)江, 楊春濤， 汪 鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510182)

目的： 探究經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道1(TRPC1)在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用。 方法: 以16HBE細(xì)胞株為研究對(duì)象，免疫熒光、RT-PCR和Western blotting檢測(cè)16HBE細(xì)胞EMT過(guò)程中TRPC1 mRNA和蛋白的表達(dá)；Western blotting檢測(cè)TRPC1阻斷劑和siRNA干擾對(duì)16HBE細(xì)胞EMT的影響。 結(jié)果: (1) TGF-β1刺激后細(xì)胞形態(tài)明顯改變，E-鈣黏蛋白表達(dá)減少 (P<0.01)，而α-SMA蛋白表達(dá)增加 (P<0.05)。(2) TRPC1廣泛存在于16HBE細(xì)胞，且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表達(dá)增加 (P<0.05)。(3) 與TGF-β1組相比，阻斷劑和TGF-β1共同作用組或siRNA和TGF-β1共同作用組細(xì)胞形態(tài)改變受抑制，E-鈣黏蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)受抑制 (P<0.05)。結(jié)論: TGF-β1誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能與其上調(diào)16HBE細(xì)胞TRPC1有關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 人支氣管上皮細(xì)胞； 瞬時(shí)受體電位通道1； 上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

支氣管哮喘是一種包括氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑是其主要3大病理特征，而氣道重塑是與氣道高反應(yīng)和哮喘嚴(yán)重程度關(guān)系最為密切的因素。哮喘氣道重塑時(shí)氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生諸多改變，其中包括氣道上皮損傷、上皮下纖維化和氣道壁網(wǎng)狀基底膜增厚等[1]。哮喘氣道上皮細(xì)胞在發(fā)生局部損傷后誘發(fā)上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，上皮細(xì)胞特征性E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少，間充質(zhì)細(xì)胞特征性α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)增加，即發(fā)生了上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。氣道上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的作用下發(fā)生EMT，參與哮喘氣道上皮下纖維化的發(fā)生，進(jìn)而參與哮喘氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展[2-3]。目前參與哮喘氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵機(jī)制尚不清楚。上皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和基因表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)分子，而研究報(bào)道Ca2+內(nèi)流參與多種細(xì)胞EMT的發(fā)生發(fā)展[4-6]。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(canonical transient receptor potential channel，TRPC)基因家族編碼的蛋白介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流，是構(gòu)成鈣庫(kù)操縱性Ca2+通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)以及受體操縱性Ca2+通道(receptor-operated Ca2+channels，ROCC)的重要分子基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣離子濃度中發(fā)揮著重要作用，特別是TRPC1和TRPC6[7-9]。研究報(bào)道TGF-β1通過(guò)增加TRPC的表達(dá)調(diào)節(jié)胞外Ca2+的內(nèi)流[10-11]，但目前尚未明確在TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制中是否有TRPC1的參與。本實(shí)驗(yàn)研究TRPC1是否參與TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，探討氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子調(diào)控機(jī)制，為臨床防治哮喘提出新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系和主要試劑

人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心保存和復(fù)蘇。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone；rhTGF-β1購(gòu)自R&D；兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體購(gòu)自Cell signaling；小鼠抗人α-SMA單克隆抗體、牛血清白蛋白、TRPC通道阻斷劑SKF96365和Triton X-100購(gòu)自Sigma;兔抗人TRPC1多克隆抗體購(gòu)自Abcam；β-actin單克隆抗體和ECL試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PrimeScriptTMRT master Mix Kit和SYBR? Premix Ex TaqTMPerfect Real Time試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)變化的觀(guān)察 16HBE細(xì)胞用含10% FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞接種于6孔板，10% FBS 培養(yǎng)24 h后，換1% FBS培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分2組處理：①對(duì)照組；② 10 μg/L TGF-β1組。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 間接免疫熒光法檢測(cè)E-鈣黏蛋白和α-SMA在16HBE細(xì)胞上的表達(dá) 將各組細(xì)胞用10% FBS培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，室溫下0.3% Triton X-100通透，5% BSA 37 ℃封閉30 min后分別加入稀釋比例為1∶100的兔抗人E-鈣黏蛋白Ⅰ抗以及小鼠抗人α-SMA的I抗100 μL，以PBS為對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，于37 ℃復(fù)溫30 min，分別加入稀釋比例為1∶100的FITC標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗100 μL，37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育5～10 min，熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍片。

2.3 Western blotting檢測(cè)E-鈣黏蛋白及α-SMA蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后按RIPA細(xì)胞裂解液說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5 min變性蛋白質(zhì)；選用5% 濃縮膠，12% 分離膠進(jìn)行電泳，分別用80 V和100 V電壓。然后在200 mA恒流、4 ℃條件下電轉(zhuǎn)2 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；分別孵育1∶1 000的兔抗人E-鈣黏蛋白Ⅰ抗、1∶500小鼠抗人α-SMA的I抗和1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3次，每次10 min；再室溫分別孵育與其I抗相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min；加入ECL反應(yīng)，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對(duì)所得到的條帶進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參照，分析各組E-鈣黏蛋白以及α-SMA 蛋白的相對(duì)含量。

2.4 間接免疫熒光、RT-PCR和Western blotting檢測(cè)TRPC1 mRNA和蛋白在16HBE細(xì)胞上表達(dá) 將第3代細(xì)胞接種于6孔板，10% FBS 培養(yǎng)24 h后，換1% FBS培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分組為：(1)1% FBS對(duì)照組；(2)10 μg/L TGF-β1+1% FBS培養(yǎng)基組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，室溫下0.3% Triton X-100通透細(xì)胞，5% BSA 37 ℃封閉30 min后加入稀釋比例為1∶100的兔抗人TRPC1的I抗100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，于37 ℃復(fù)溫30 min，加入稀釋比例為1∶100的FITC標(biāo)記的山羊抗兔的Ⅱ抗100 μL，37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育5～10 min，實(shí)驗(yàn)中，用PBS代替I抗作為陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍片。

細(xì)胞分組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后提取總RNA，合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，TRPC1上游和下游的引物序列分別為5’-GATGTTTGGCCAGTCCAGCTC-3’和5’-ATTCCGGGCTTGTGCAAGTAA-3’，以18S為內(nèi)參照，逆轉(zhuǎn)錄條件: 37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。然后再按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ Perfect Real Time試劑盒說(shuō)明書(shū)用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次，熔解曲線(xiàn)分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法計(jì)算各組TRPC1的相對(duì)表達(dá)量。

將上面分組細(xì)胞處理24 h、48 h和72 h后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，分別孵育1∶1 000的兔抗人TRPC1的I抗及1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。再室溫分別孵育與其I抗相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 1 h；加入ECL反應(yīng)，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對(duì)所得到的條帶進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參照，分析各組TRPC1蛋白的相對(duì)含量。

2.5 倒置顯微鏡和Western blotting檢測(cè)TRPC1阻斷劑和siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)EMT的影響 通過(guò)Ambion 公司網(wǎng)站，獲取沉默TRPC1基因(GenBank No.NM-00125 1845.1)的靶序列，合成正義和反義RNA鏈，序列分別為5’-CCACCUGUAAGAAGAUAAUTT-3’和5’-AUUAUCUUCUUACAGGUGGTT-3’，提交序列給上海吉瑪公司合成siRNA。第3代細(xì)胞接種于6孔板中，10% FBS培養(yǎng)12～18 h，細(xì)胞密度30%～50%時(shí)，再按照以下分組處理：(1)mock transfection(轉(zhuǎn)染試劑)對(duì)照組；(2)mock transfection +TRPC1 siRNA組；(3)10 μg/L TGF-β1；(4)10 μg/L TGF-β1 + mock transfection +TRPC1 siRNA組；(5)mock transfection + negative siRNA陰性對(duì)照組；(6)10 μg/L TGF-β1+ mock transfection + negative siRNA組；(7)GAPDHsiRNA + mock transfection 陽(yáng)性對(duì)照組。按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組mRNA抑制率達(dá)80%左右，合成的siRNA序列有效。接種第3代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為：(1)對(duì)照組；(2)15 μmol/L SKF96365對(duì)照組；(3)siRNA-TRPC1 +對(duì)照組；(4)10 μg/L TGF-β1組；(5)15 μmol/L SKF96365 + 10 μg/L TGF-β1組；(6)siRNA-TRPC1 + 10 μg/L TGF-β1組, 處理48 h后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，并提取細(xì)胞蛋白，Western blotting分析各組E-鈣黏蛋白以及α-SMA蛋白的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料間比較在確定方差齊后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間的多重比較采用LSD法；如果方差不齊則采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 16HBE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

在倒置顯微鏡下觀(guān)察到16HBE細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，形成融合的單層細(xì)胞，呈立方形或小鵝卵石形, 胞間連接緊密，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征。TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細(xì)胞72 h 后，部分細(xì)胞肥大，伸長(zhǎng)呈梭形，細(xì)胞間隙增大，喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Morphologic changes induced by TGF-β1 for 72 h observed under inverted microscope (×100).

2 E-鈣黏蛋白及α-SMA在16HBE細(xì)胞的定位

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白在正常16HBE細(xì)胞中高表達(dá)， TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細(xì)胞48 h后，E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯減弱。正常16HBE細(xì)胞微量表達(dá)α-SMA，而TGF-β1刺激細(xì)胞48 h后，α-SMA表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Immunofluorescence staining for E-cadherin and α-SMA (green) as well as DAPI-stained nucleus (blue) in 16HBE cells treated with TGF-β1 for 48 h (×200).

3 E-鈣黏蛋白及α-SMA蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組的16HBE細(xì)胞表達(dá)E-鈣黏蛋白；TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細(xì)胞48 h和72 h組后，E-鈣黏蛋白表達(dá)量明顯減少，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。對(duì)照組的16HBE細(xì)胞表達(dá)微量α-SMA蛋白，TGF-β1 (10 μg/L) 刺激48 h和72 h后，α-SMA蛋白表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The protein expression of E-cadherin in 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of E-cadherin protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group.

Figure 4.The protein expression of α-SMA in the 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of α-SMA protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

4 TRPC1在16HBE細(xì)胞的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組的16HBE細(xì)胞表達(dá)TRPC1 的mRNA，TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，TRPC1的 mRNA表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)。用兔抗人TRPC1抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，可見(jiàn)TRPC1廣泛存在于16HBE細(xì)胞，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The mRNA expression of TRPC1 in the 16HBE cells detected by real-time PCR (A) and the protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells detected by immunofluorescence cytochemistry (B). Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

5 TRPC1蛋白在16HBE細(xì)胞的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組的16HBE細(xì)胞表達(dá)TRPC1蛋白；TGF-β1 (10 μg/L) 刺激24 h、48 h和72 h后，TRPC1蛋白表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of TRPC1 protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

6 SKF96365和siRNA干擾對(duì)EMT的影響

倒置顯微鏡下觀(guān)察顯示，TGF-β1(10 μg/L)與SKF96365(15 μmol/L)共同作用于16HBE 細(xì)胞48 h或用siRNA干擾24 h再加入TGF-β1刺激細(xì)胞48 h，16HBE細(xì)胞的形態(tài)改變均受抑制，見(jiàn)圖7。Western blotting結(jié)果顯示：TGF-β1(10 μg/L)與SKF96365(15 μmol/L)共同作用于16HBE 細(xì)胞48 h或用siRNA干擾 24 h再用TGF-β1刺激細(xì)胞48 h，由TGF-β1誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白表達(dá)量減少受抑制，與TGF-β1組比較顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖8；而細(xì)胞的α-SMA蛋白表達(dá)量增加受抑制，與TGF-β1組比較顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

討 論

支氣管哮喘是常見(jiàn)的慢性氣道炎癥，嚴(yán)重危害人類(lèi)的身心健康，而且，近年來(lái)哮喘發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢(shì)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀(guān)察分析發(fā)現(xiàn)，氣道重塑與哮喘患者的預(yù)后關(guān)系密切。因而，研究氣道重塑的機(jī)制對(duì)于提高哮喘的治療效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

EMT是指上皮細(xì)胞形態(tài)和生物功能向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，其特征主要表現(xiàn)為上皮E-鈣黏蛋白或緊密連接蛋白表達(dá)減少或丟失，失去細(xì)胞間緊密連接，導(dǎo)致上皮失去極性，獲得浸潤(rùn)性和游走遷移能力。臨床研究發(fā)現(xiàn)上皮下纖維化的主要原因是壁網(wǎng)狀基底膜下肌纖維母細(xì)胞數(shù)量增多，而肌纖維母細(xì)胞可由氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)。氣道上皮細(xì)胞在發(fā)生局部損傷或缺氧或生長(zhǎng)因子等作用下，上皮細(xì)胞的黏附分子如E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，間充質(zhì)細(xì)胞特征性α-SMA表達(dá)增加，即發(fā)生EMT。上皮細(xì)胞向表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，可作為肌纖維母細(xì)胞一個(gè)新的來(lái)源，參與氣道重塑。這提示氣道上皮可以作為治療哮喘的重要靶點(diǎn)，有效抑制氣道上皮細(xì)胞的間質(zhì)化可能改善哮喘癥狀。

Figure 7.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the morphological changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 (×100). A: the 16HBE cells treated without TGF-β1 for 48 h; B: the 16HBE cells treated with TGF-β1 for 48 h; C: the 16HBE cells treated with SKF96365 for 48 h; D: the 16HBE cells treated with TGF-β1 and SKF96365 for 48 h; E: the 16HBE cells treated with TRPC1 siRNA for 48 h; F: the 16HBE cells treated with TRPC1 siRNA for 24 h, then treated with TGF-β1 for 48 h.

Figure 8.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the E-cadherin protein expression in the 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression levels of E-cadherin protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group.

Figure 9.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the α-SMA protein expression in the 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression levels of α-SMA protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group.

TGF-β超家族是一類(lèi)由2個(gè)結(jié)構(gòu)相同或相近的二硫鍵相連形成的二聚體多肽，哺乳動(dòng)物TGF-β 家族至少包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 共3種亞型，其中TGF-β1所占比例最高，生物活性最強(qiáng)。根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)和功能，TGF-β 受體分為I 型受體(Tβ RI)和II 型受體(TβRII)兩大類(lèi)。TGF-β 與Tβ RII結(jié)合后使Tβ RI 發(fā)生磷酸化，使TGF-β 發(fā)揮調(diào)控EMT 的生物學(xué)作用。抑制TβRII可逆轉(zhuǎn)和抑制EMT的發(fā)生，TβRII缺失和EMT的下調(diào)密切相關(guān)。此外，抑制TβRI受體也可阻斷TGF-β 誘導(dǎo)的EMT，使用TβRI化學(xué)受體阻滯劑和干擾TβRI基因都能阻斷EMT的發(fā)生并促進(jìn)上皮細(xì)胞表型的表達(dá)。研究認(rèn)為，TGF-β 誘導(dǎo)的EMT主要通過(guò)Smads 依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。許多研究證明Smads 信號(hào)在TGF-β 誘導(dǎo)的EMT中起重要作用。TGF-β 通過(guò)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化而激活，導(dǎo)致 Smad2 和Smad3 磷酸化，再與 Smad4 結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控 EMT的發(fā)生[12]。作為一個(gè)重要的致纖維化因子，TGF-β1能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)功能向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而參與氣道纖維化而導(dǎo)致病理生理改變。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者肺泡灌洗液及氣道壁內(nèi)TGF-β1增高，而體外的實(shí)驗(yàn)研究亦表明損傷的氣道上皮細(xì)胞分泌TGF-β1增多[13]。他們的研究證實(shí)氣道上皮細(xì)胞在TGF-β1的作用下發(fā)生EMT，參與哮喘氣道上皮下纖維化的發(fā)生，進(jìn)而參與哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展[11]。

Ca2+是多種受體激活后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。Berridge等[14]的研究表明Ca2+內(nèi)流的改變?cè)贓MT的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且主要是SOCC的改變引起的Ca2+內(nèi)流，其確切的激活機(jī)制及涉及的通道尚需更多研究確認(rèn)。越來(lái)越多的研究表明TRPCs通道蛋白參與鈣庫(kù)操縱性Ca2+內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，特別是TRPC1通道。Vergara等[15]研究顯示當(dāng)TRPC1基因沉默或者TRPC1蛋白表達(dá)降低，鈣離子內(nèi)流減少，細(xì)胞內(nèi)自由Ca2+濃度降低。反之，TRPC1蛋白表達(dá)增多，鈣離子內(nèi)流增加，細(xì)胞內(nèi)自由Ca2+濃度升高。因此，研究TRPC1通道與氣道上皮細(xì)胞EMT的關(guān)系具有十分重要的意義和應(yīng)用前景。

本課題組用TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，結(jié)果提示16HBE細(xì)胞培養(yǎng)72 h，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征。TGF-β1 作用細(xì)胞72 h后，細(xì)胞伸長(zhǎng)呈梭形，喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式，而且上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯減弱，肌纖維母細(xì)胞的表型標(biāo)志物α-SMA表達(dá)明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即氣道上皮細(xì)胞在TGF-β1的作用下發(fā)生EMT。檢測(cè)TRPC1在16HBE細(xì)胞上的表達(dá)，結(jié)果提示TRPC1在16HBE細(xì)胞上廣泛表達(dá)。用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)了TGF-β1作用后TRPC1 mRNA和蛋白在16HBE細(xì)胞上表達(dá)變化，結(jié)果顯示TGF-β1作用后TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上升，而且其改變具有時(shí)間依賴(lài)性，推測(cè)TRPC1可能在TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生EMT中發(fā)揮了重要作用。

為證實(shí)這個(gè)推論，我們用TGF-β1與SKF96365 共同作用于細(xì)胞，結(jié)果與TGF-β1組比較，顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞間質(zhì)化的作用；用siRNA干擾16HBE細(xì)胞的TRPC1基因，再用TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞48 h，結(jié)果與TGF-β1組比較，顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞間質(zhì)化的作用，這證實(shí)了TRPC1參與TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究表明，TGF-β1上調(diào)了TRPC1的表達(dá)，TRPC1阻斷劑SKF96365和干擾16HBE細(xì)胞的TRPC1基因均抑制TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的EMT，提示TRPC1參與了TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞EMT過(guò)程，且這一過(guò)程可能與其影響胞漿內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。當(dāng)然，若進(jìn)一步明確TRPC1通道參與TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞間質(zhì)化與胞漿內(nèi)鈣離子濃度這兩者之間的關(guān)系，尚需深入研究。

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Effects of TRPC1 on TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of human bronchial epithelial cells

YUE Xi-lei, CHENG Ying, XU Ji-de, ZHONG Chang-jiang, YANG Chun-tao, WANG Peng

(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China.E-mail:xujide@163.com)

AIM: To investigate the role of canonical transient receptor potential channel 1 (TRPC1) in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human bronchial epithelial (HBE) cells induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). METHODS: EMT of 16HBE cells induced by TGF-β1 were identified by microscopy, immunofluorescence and Western blotting. Immunofluorescence, real-time PCR and Western blotting were applied to detect the mRNA and the protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells. The influence of SKF96365 (a TRPC1 blocker) and siRNA-mediated silencing ofTRPC1 on the EMT of the 16HBE cells were detected by microscopy and Western blotting. RESULTS: Treatment with TGF-β1 induced significant morphological changes of the 16HBE cells. Exposure to TGF-β1 decreased the expression of E-cadherin protein (P<0.01) and increased the expression of α-SMA protein (P<0.05) in the 16HBE cells. Immunofluorescence observation indicated that TRPC1 expression in the 16HBE cells was positive. The expression of TRPC1 at mRNA and protein levels was significantly increased in the 16HBE cells after stimulation with TGF-β1 (P<0.05). The morphological changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 were inhibited by SKF96365 andTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group. The protein expression of E-cadherin and α-SMA induced by TGF-β1 were inhibited by SKF96365 andTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group (P<0.05). CONCLUSION: TGF-β1 induces EMT with the mechanism of up-regulating TRPC1 in human bronchial epithelial cells.

Transforming growth factor-β1; Human bronchial epithelial cell; Transient receptor potential channel 1; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2015)03- 0492- 07

2014- 07- 23

2014- 12- 16

廣東省科技計(jì)劃(No. 2012145)； 廣州市高?？萍柬?xiàng)目(No. 10A149)

△通訊作者 Tel: 020-81340199; E-mail: xujide@163.com

▲并列第1作者

R363.2； R562.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.019