張瓊麗， 羅紅軍， 李 慧， 林哲絢， 羅文鴻

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室， 廣東 汕頭 515041)

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SSAO介導(dǎo)的氧化脫氨反應(yīng)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用*

張瓊麗， 羅紅軍， 李 慧， 林哲絢， 羅文鴻△

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室， 廣東 汕頭 515041)

目的： 觀察氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)催化其底物甲胺(MA)和苯甲胺(BZA)的氧化脫氨反應(yīng)對(duì)成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用。方法: 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞；高效液相色譜法檢測(cè)不同分化天數(shù)下細(xì)胞SSAO活性的變化；MTT法檢測(cè)不同濃度的MA或BZA對(duì)細(xì)胞活力的影響；熒光探針?lè)椒z測(cè)細(xì)胞在藥物作用下產(chǎn)生的活性氧；以0.5 mmol/L MA或BZA處理成熟脂肪細(xì)胞或未經(jīng)誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞4 h，觀察細(xì)胞產(chǎn)生的甲醛(FA)、苯甲醛(BZ)、脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽(GSH)的變化。結(jié)果: SSAO活性隨細(xì)胞分化天數(shù)的增加而增加，并于第8天達(dá)到高峰；不同濃度MA或BZA作用細(xì)胞4 h對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)；0.5 mmol/L MA或BZA孵育后，細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧增高，約為陰性對(duì)照組的3～4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在成熟脂肪細(xì)胞中，MDA的含量增加，而T-SOD和GSH的活性和含量減少，與陰性對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MA和BZA作用未經(jīng)誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞，其MDA和SOD和GSH的變化不明顯，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論: SSAO可能通過(guò)其介導(dǎo)的氧化脫氨反應(yīng)引起3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

氨基脲敏感型胺氧化酶； 脂肪細(xì)胞； 甲胺； 苯甲胺； 氧化應(yīng)激

大量的研究發(fā)現(xiàn)肥胖是糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一[1-4]，這可能與肥胖者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高有關(guān)。研究表明氧化應(yīng)激可以干擾胰島素誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)的胰島素受體基質(zhì)-1和磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的重分布，降低細(xì)胞膜上胰島素受體的敏感性，并使細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT-4)表達(dá)減少，這些都與胰島素抵抗的發(fā)生有直接關(guān)系[5-6]。因此，探討脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生因素具有科學(xué)意義。

氨基脲敏感型胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase, SSAO)是一類(lèi)催化胺類(lèi)化合物氧化脫氨，含Cu2+，并以6-羥基多巴醌為輔酶，對(duì)氨基脲敏感的胺氧化酶的統(tǒng)稱(chēng)。其反應(yīng)底物主要是伯胺類(lèi)化合物，催化產(chǎn)生相應(yīng)的醛、過(guò)氧化氫及氨。有報(bào)道體內(nèi)存在的甲胺，經(jīng)SSAO催化生成的甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)、過(guò)氧化氫可通過(guò)協(xié)同增強(qiáng)氧化應(yīng)激，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。SSAO在成熟脂肪細(xì)胞中大量存在，且與細(xì)胞的分化程度有關(guān)。目前研究認(rèn)為，SSAO在脂肪細(xì)胞中可參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，具有類(lèi)胰島素的作用[8-10]。但其在脂肪細(xì)胞中的確切病理生理功能仍不甚清楚。由于成熟脂肪細(xì)胞高表達(dá)SSAO，而體內(nèi)同時(shí)存在內(nèi)源性底物(甲胺，氨基丙酮等)，因此，我們猜測(cè)SSAO可能參與了脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激。本文以3T3-L1脂肪細(xì)胞為模型，以甲胺、苯甲胺為底物探討SSAO在脂肪細(xì)胞中的病理生理意義。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清( Hyclone)；青霉素-鏈霉素雙抗、BCA蛋白定量試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)；胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein 3’,6’-diacetate，DCFH-DA)、氯吉靈、帕吉林、苯甲胺(benzylamine，BZA)、甲胺(methylamine，MA)、2,4-二硝基苯肼(dinitrophenyl hydrazine，DNPH； Sigma)；油紅O、Triton X-100、胰蛋白酶(1∶250)(Amresco)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase， T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

2 方法

2.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和鑒定 在37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下，3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素-1×105U/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，每2～3 d換液，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代或接種。

將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，大約2～3 d細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底后，細(xì)胞接觸抑制開(kāi)始，換新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，換以含有0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L地塞米松和10 mg/ L胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(誘導(dǎo)分化液Ⅰ，此時(shí)為分化第0天)，60 h后更換僅含有10 mg/L胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(誘導(dǎo)分化液Ⅱ)繼續(xù)培養(yǎng)60 h，之后每2 d更換1次基礎(chǔ)培養(yǎng)液，直到細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。

油紅O染色法鑒定細(xì)胞：先吸棄培養(yǎng)基，用PBS漂洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS漂洗3次，等細(xì)胞自然風(fēng)干之后加入油紅O工作液，室溫下染色1 h，棄去染液，PBS漂洗，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX70-S1F2)下觀察，并拍照紀(jì)錄。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞SSAO活性 將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，從細(xì)胞誘導(dǎo)分化開(kāi)始，分別在第0、1、3、5、7、8、9、10天收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行酶活性的檢測(cè)：取200 μL的細(xì)胞懸液于1.5 mL的EP管中，加入20 μL單胺氧化酶抑制劑，混勻，室溫下孵育30 min；加入180 μL的苯甲胺，混勻，37 ℃ 水浴1 h， 之后加入100 μL三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)(20%W/V)終止反應(yīng)，12 000 r/min 離心8 min，取300 μL上清液于5 mL的玻璃離心管中，加入50 μL的DNPH(3 g/L)混勻1 min，40 ℃ 水浴15 min，之后用乙酸乙酯萃取2次，每次1 mL， 混勻后離心5 min， 取上層液于45 ℃ 下氮?dú)?N2)吹干，之后用500 μL乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解，上樣分析檢測(cè)。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞按1×104細(xì)胞每孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按上述細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法將細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，含0.5% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的DMEM(無(wú)血清)培養(yǎng)基孵育細(xì)胞6 h，之后換以含0.1 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L的MA或BZA的無(wú)血清培養(yǎng)基分別孵育細(xì)胞4 h、12 h、24 h,以等體積溶劑作為陰性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。孵育結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶，低速搖勻10 min后，酶標(biāo)儀(Thermo)490 nm處測(cè)定吸光值(A)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：處理組A/對(duì)照組A×100%。

2.4 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的水平 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，預(yù)孵含0.5% BSA的DMEM(無(wú)血清)培養(yǎng)基6 h，之后用不同濃度MA或BZA(0、0.1、0.25、0.5 mmol/L)與20 μmol/L DCFH-DA熒光染料共同孵育細(xì)胞1 h，PBS洗3次后，各孔加入500 μL 0.1% Triton X-100，搖床裂解10 min，收集裂解液，離心取上清。用熒光分光光度計(jì)(RF-5000，SHIMADZU)在485 nm激發(fā)波長(zhǎng)和530 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。同時(shí)與未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞做對(duì)比。

2.5 甲醛或苯甲醛和脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的檢測(cè) 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，按上述方法將細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，預(yù)孵含0.5% BSA的DMEM(無(wú)血清)培養(yǎng)基6 h，之后用含0.5 mmol/L MA或BZA的無(wú)血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞4 h，孵育結(jié)束后，在冰上，PBS洗3次，用細(xì)胞刮鏟收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，3 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。

將細(xì)胞懸液按照參考文獻(xiàn)[11-12]的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甲醛(FA)或苯甲醛(benzaidehyde，BZ)的含量。取200 μL細(xì)胞懸液于帶蓋螺口玻璃瓶，加入800 μL雙蒸水，100 μL氨芐西林水溶液(2.5 g/L)和250 μL TCA，旋緊瓶蓋后振蕩30 s，90 ℃水浴1 h后；冰浴30 min，將瓶?jī)?nèi)物質(zhì)完全轉(zhuǎn)移到離心管中，加入約0.5 g NaCl，振蕩1 min，2 000 r/min離心5 min，取上層液，用乙醚再萃取1次，合并2次萃取液于40 ℃下N2吹干，之后用500 μL乙腈-0.01%甲酸水溶液(50∶50，V/V)溶解，上樣分析檢測(cè)甲醛含量。取200 μL細(xì)胞懸液于1.5 mL的EP管中，加入200 μL PBS混勻后，加入100 μL TCA漩渦混勻30 s，12 000 r/min離心8 min，取300 μL上清液于離心管中，加入50 μL DNPH混勻1 min，40 ℃水浴15 min，之后用乙酸乙酯萃取2次，混勻后離心，取上層液于45 ℃下N2吹干，之后用乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解，上樣分析檢測(cè)苯甲醛含量。

將上述處理的細(xì)胞按MDA、T-SOD、GSH檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)上說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)樣本進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的檢測(cè)和分析，不加藥的為陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)與未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞做對(duì)比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)纖維型，胞質(zhì)中不含脂滴(圖1A)；經(jīng)誘導(dǎo)分化8 d左右，有95%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)成熟脂肪細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴，并環(huán)繞于胞膜內(nèi)，呈指環(huán)狀(圖1B)；經(jīng)油紅O染色可見(jiàn)脂肪細(xì)胞內(nèi)大量柚紅色顆粒(圖1C)。

Figure 1.Morphologies of 3T3-L1 cells. A: 3T3-L1 cells before differentiation; B: adipocyte of 8th d after differentiation; C: adipocytes stained with oil red O.

2 3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中SSAO活性的變化

誘導(dǎo)分化的前3 d，酶活性無(wú)明顯變化，第5天開(kāi)始，細(xì)胞的SSAO活性顯著升高，第8～9天，酶活性達(dá)到最高，之后又呈下降的趨勢(shì)，第8天和第9天差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3天之后的每一組均顯著高于未誘導(dǎo)分化組(第0天)(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選擇誘導(dǎo)分化到第8天的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此時(shí)SSAO活性較高，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The alteration of SSAO activity during 3T3-L1 cells differentiation. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 d.

3 SSAO底物MA和BZA對(duì)成熟脂肪細(xì)胞活力的影響

3 mmol/L MA孵育12 h和0.5、1及3 mmol/L MA孵育24 h均顯著降低細(xì)胞活力(P<0.05)；3 mmol/L BZA孵育4 h和12 h與0.1 mmol/L～3 mmol/L BZA孵育24 h也顯著降低細(xì)胞活力(P<0.05)。其余各濃度和時(shí)點(diǎn)的MA、BZA作用均對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，見(jiàn)表1。

4 MA和BZA對(duì)3T3-L1細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

和陰性對(duì)照組相比，0.1～0.5 mmol/L MA和BZA引起成熟脂肪細(xì)胞ROS顯著增加(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，0.5 mmol/L MA和BZA活性氧為陰性對(duì)照組的3倍左右。但和陰性對(duì)照組比較，0.5 mmol/L MA和BZA對(duì)未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞活性氧產(chǎn)生無(wú)顯著差異(P>0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用無(wú)明顯細(xì)胞毒性的0.5 mmol/L的底物作用細(xì)胞4 h，見(jiàn)圖3。

表1 SSAO底物MA或BZA 作用4、12、24 h對(duì)脂肪細(xì)胞活力的影響

*P<0.05vs0 mmol/L group.

5 SSAO介導(dǎo)MA和BZA分別產(chǎn)生FA和BZ

0.5 mmol/L MA作用4 h細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞產(chǎn)生的FA含量增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.5 mmol/L BZA作用4 h細(xì)胞后，細(xì)胞及培養(yǎng)基中BZ含量均增加，與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、3。

6 SSAO底物對(duì)成熟脂肪細(xì)胞和未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞MDA和T-SOD、GSH的影響

在成熟脂肪細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，MA或BZA組對(duì)細(xì)胞MDA的產(chǎn)生、T-SOD活力和GSH含量變化都有顯著差異(P<0.05)，0.5 mmol/L MA和BZA顯著增加細(xì)胞MDA含量(P<0.05)，并降低T-SOD活力(P<0.05)。MA組MDA含量比對(duì)照組增加約3倍，BZA組約增加4倍；T-SOD活力均減少30%左右；MA處理過(guò)的細(xì)胞GSH含量比對(duì)照組減少約30%，BZA組減少一半左右。在未誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，MA和BZA組細(xì)胞MDA的產(chǎn)生、T-SOD活力和GSH含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

SSAO主要以2種方式存在于人和動(dòng)物的體內(nèi)，一種是以游離形式存在于血液中，另一種是以膜結(jié)合型形式存在于組織中，尤以脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的SSAO含量豐富[13-15]。本實(shí)驗(yàn)表明，3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程中，細(xì)胞表達(dá)SSAO增高從而表現(xiàn)出逐漸升高的酶活性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往報(bào)道相符[16]。SSAO的反應(yīng)底物主要是伯胺類(lèi)化合物，目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性底物有甲胺和氨基丙酮等。甲胺主要來(lái)源于體內(nèi)肌酸、膽堿、腎上腺素代謝，也可從飲食或吸煙中攝入；而氨基丙酮?jiǎng)t由蘇氨酸和甘氨酸代謝產(chǎn)生。甲胺在體內(nèi)組織和尿液均有存在[17]。體內(nèi)胺類(lèi)物質(zhì)并無(wú)明顯毒性，但胺在SSAO存在的情況下可產(chǎn)生活性氧及醛類(lèi)[18]。甲醛可增強(qiáng)體內(nèi)蛋白糖基化，引起DNA蛋白交聯(lián)，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，被認(rèn)為與一些重大疾病相關(guān)。此外，它可以與過(guò)氧化氫發(fā)生協(xié)同作用造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。有研究證明SSAO及其代謝產(chǎn)物與內(nèi)分泌或心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等[19-21]。

Figure 3.Production of ROS after exposure of 3T3-L1 mature adipocytes to MA or BZA. Mean±SD. n=3. *P <0.05 vs 0 mmol/L group.

表2 SSAO介導(dǎo)其底物甲胺產(chǎn)生甲醛

*P<0.05vs0 mmol/L group.

表3 SSAO介導(dǎo)其底物苯甲胺產(chǎn)生苯甲醛

*P<0.05vs0 mmol/L group.

Figure 4.Effects of SSAO substrates MA,BZA on oxidative stress in the preadipocytes and adipocytes. After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, MDA(A), T-SOD(B) and GSH(C) in the adipocytes or preadipocytes were measured. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group．

機(jī)體代謝過(guò)程中可不斷地通過(guò)酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，在生理?xiàng)l件下，活性氧的生成和清除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。當(dāng)體內(nèi)受內(nèi)源性或外源性刺激，可發(fā)生代謝異常，導(dǎo)致大量活性氧自由基產(chǎn)生或抗氧化物質(zhì)不足，使生理?xiàng)l件下氧化與抗氧化系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，進(jìn)而使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化損傷生物分子，進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡和組織損傷，這與很多病理過(guò)程相關(guān)，如肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等[22]。肥胖相關(guān)的一些病癥是一個(gè)長(zhǎng)期慢性的過(guò)程，而內(nèi)源性胺類(lèi)物質(zhì)體內(nèi)濃度不高，因此研究胺類(lèi)物質(zhì)的短期急性細(xì)胞毒性并無(wú)太大的臨床意義。本文通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)確定一個(gè)在不顯著影響細(xì)胞活力的情況下[在較低的底物濃度(0.5 mmol/L)和較短的培養(yǎng)時(shí)間(4 h)]，研究藥物對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，看細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)的變化，包括氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物中的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物——丙二醛，抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化酶——超氧化物歧化酶和非酶抗氧化劑——谷胱甘肽，這3個(gè)指標(biāo)可從不同角度反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度和抗氧化能力的變化。細(xì)胞在處于氧化應(yīng)激壓力下并不一定會(huì)快速出現(xiàn)活力下降或凋亡壞死，但氧化應(yīng)激長(zhǎng)期存在可能會(huì)通過(guò)改變細(xì)胞正常功能、影響細(xì)胞代謝等，從而影響機(jī)體健康。

本研究發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L MA或BZA可引起高表達(dá)SSAO的成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生活性氧并可檢測(cè)到甲醛、苯甲醛代謝產(chǎn)物的生成，說(shuō)明該過(guò)程中與SSAO的氧化脫氨反應(yīng)有關(guān)。不同濃度BZA產(chǎn)生的細(xì)胞活性氧的量都比相應(yīng)濃度的MA要稍微高些，這可能與BZA對(duì)SSAO的親和力比MA強(qiáng)有關(guān)。本研究通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L MA或BZA作用細(xì)胞4 h可引起MDA含量增高，說(shuō)明細(xì)胞存在脂質(zhì)過(guò)氧化；而T-SOD和GSH活性降低，表明脂肪細(xì)胞抗氧化能力下降。但這種現(xiàn)象在不表達(dá)SSAO酶活性的前脂肪細(xì)胞中并未出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞活力還沒(méi)有顯著下降時(shí)，藥物可增強(qiáng)成熟脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激，并通過(guò)高表達(dá)SSAO的成熟脂肪細(xì)胞和不表達(dá)SSAO的前脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)的對(duì)比，推斷SSAO介導(dǎo)的胺類(lèi)底物氧化脫氨參與了脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而有可能參與了脂肪細(xì)胞氧化損傷相關(guān)疾病的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SSAO可介導(dǎo)其底物發(fā)生的氧化脫氨反應(yīng)產(chǎn)生活性代謝物，從而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。該研究提示SSAO可能作為對(duì)抗脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的靶點(diǎn)，可通過(guò)應(yīng)用特異性SSAO抑制劑減緩與肥胖相關(guān)的代謝綜合癥的發(fā)生發(fā)展。

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NOD2通過(guò)IRF4抑制RICK和TRAF6的K63多聚泛素化而減輕結(jié)腸炎癥

現(xiàn)已證實(shí)，半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活化和募集結(jié)構(gòu)域15(recruitment domain 15, CARD15)基因(克羅恩病的主要危險(xiǎn)因素)的多態(tài)性可導(dǎo)致核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain 2, NOD2)功能喪失。然而，這種功能喪失是如何導(dǎo)致克羅恩病的易感性增加，其分子機(jī)制尚不清楚。已知人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞中活化的NOD2可通過(guò)其配體胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP)減輕Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Watanabe等發(fā)現(xiàn)，NOD2活化可使干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)表達(dá)增加，并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)和受體相互作用絲氨酸-蘇氨酸激酶(receptor interacting serine-threonine kinase, RICK)結(jié)合。這種結(jié)合導(dǎo)致TRAF6和RICK的第63位賴(lài)氨酸(K63)相關(guān)多聚泛素化(polyubiquitination)被抑制，該抑制作用由IRF4介導(dǎo)，從而下調(diào)NF-κB的活化。該研究還證實(shí)，通過(guò)給予MDP或IRF4可以阻止小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的進(jìn)展，這種保護(hù)作用與小鼠結(jié)腸固有層單個(gè)核細(xì)胞中IRF4介導(dǎo)的TRAF6和RICK多聚泛素化的抑制有關(guān)。因此，這些發(fā)現(xiàn)可以解釋NOD2介導(dǎo)的針對(duì)腸道菌群的固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制，并由此闡明CARD15多態(tài)性與所導(dǎo)致的NOD2功能紊亂在克羅恩病中的關(guān)系。

Mucosal Immunol, 2014, 7(6):1312-1325(周 晗)

Effect of deamination reaction mediated by semicarbazide-sensitive amine oxidase on 3T3-L1 adipocytes

ZHANG Qiong-li, LUO Hong-jun, LI Hui, LIN Zhe-xuan, LUO Wen-hong

(BioanalyticalLaboratory,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:whluo@stu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of the metabolites generated from oxidative deamination of methylamine (MA) or benzylamine (BZA) catalyzed by semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) on 3T3-L1 adipocytes. METHODS: 3T3-L1 preadipocytes were induced to differentiation. SSAO activity was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) at different differentiation time points. MTT assay was applied to detect cell vitality after exposure to different concentrations of MA or BZA. Fluorescence probe DCFH-DA was used to determine the production of reactive oxygen species after incubation of 3T3-L1 adipocytes with MA or BZA. After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, malondialdehyde (MDA), total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione (GSH) in the adipocytes or preadipocytes were measured. RESULTS: SSAO activity increased with the increase in the differentiation days, and reached a maximum at the 8th day. Incubation of the cells with different concentrations of MA or BZA for 4 h did not significantly decreased the cell vitality (P>0.05). After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA, the reactive oxygen species in adipocytes significantly increased, and were about 3 to 4 times as compared with control group (P<0.05). After treatment with 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, MDA content significantly increased, while the activity of SOD and the expression of GSH decreased in mature adipocytes compared with control group (P<0.05). However, MDA, T-SOD and GSH did not change significantly after treatment with equal molar of MA or BZA in the preadipocytes (P>0.05). CONCLUSION: MA or BZA induces oxidative stress in the mature adipocytes, which might result from the deamination products catalyzed by SSAO.

Semicarbazide-sensitive amine oxidase; Adipocytes; Methylamine; Benzene methylamine; Oxidative stress

1000- 4718(2015)03- 0468- 07

2014- 10- 16

2014- 11- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170315); 廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(No. 9351507102000-001)

△通訊作者 Tel:0754-8900532; E-mail: whluo@stu.edu.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.015