彭晴霞， 楊碧瑩， 潘經(jīng)銳， 王鴻軒， 黎祥噴， 王藝東△

(1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院神經(jīng)科， 2廣東省中醫(yī)院神經(jīng)四科，廣東 廣州 510120)

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氧葡萄糖剝奪-再恢復后抑制小膠質細胞TLR9激活對神經(jīng)元的保護作用*

彭晴霞1， 楊碧瑩2， 潘經(jīng)銳1， 王鴻軒1， 黎祥噴1， 王藝東1△

(1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院神經(jīng)科，2廣東省中醫(yī)院神經(jīng)四科，廣東 廣州 510120)

目的： 觀察氧葡萄糖剝奪-再恢復(OGDR)后小膠質細胞BV-2 Toll 樣受體9(TLR9)激活對神經(jīng)元凋亡的影響。方法: 對BV-2細胞或TLR9-siRNA轉染的BV-2細胞進行OGDR處理4 h后，將細胞上清添加至OGDR處理4 h的小鼠原代皮層神經(jīng)元中，繼續(xù)正常培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡，Western blotting 檢測神經(jīng)元caspase-3蛋白的表達。實驗分為正常BV-2組、negative control-siRNA組、TLR9-siRNA組、OGDR組、OGDR+NC-siRNA組、OGDR+TLR9-siRNA組和對照組(神經(jīng)元OGDR后不添加BV-2細胞上清)。結果: OGDR后神經(jīng)元胞體腫脹，折光性下降，出現(xiàn)空泡樣變，軸突變細、扭曲、斷裂。TUNEL染色各組均可見綠染凋亡小體。與對照組比較，其它組的caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)；與正常BV-2組比較，OGDR組和TLR9-siRNA組的caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)；OGDR+TLR9-siRNA轉染組與TLR9-siRNA轉染組和OGDR組比較，caspase-3蛋白表達下降(P<0.05)。結論: OGDR后BV-2細胞TLR9激活致神經(jīng)元凋亡增多，caspase-3蛋白表達升高；抑制TLR9表達后，神經(jīng)元損傷減輕。

氧葡萄糖剝奪-再恢復； 小膠質細胞； 神經(jīng)元； Toll 樣受體9

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在啟動機體的炎癥反應中起著重要作用[1]。腦缺血再灌注損傷中炎癥反應占據(jù)重要地位。近年來的研究發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4表達上調與腦缺血的嚴重性相關，基因敲除動物的腦缺血轉歸更好[2]。我們在前期研究中觀察到，腦梗死小鼠梗死灶外周組織TLR9選擇性地在小膠質細胞內激活[3]，氧葡萄糖剝奪-再恢復(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGDR)后小膠質細胞(BV-2細胞)的TLR9表達增加[4]。腦缺血再灌注后小膠質細胞TLR9的激活是否對神經(jīng)元產(chǎn)生作用，影響缺血組織的轉歸，目前還未見研究報道。本研究采用 OGDR模型在體外模擬腦缺血/再灌注的體內過程，用小鼠BV-2小膠質細胞、原代皮層神經(jīng)元作為體外研究小膠質細胞、神經(jīng)元的細胞體系，將經(jīng)OGDR處理和TLR9基因沉默后的BV-2細胞上清加入經(jīng)OGDR處理的神經(jīng)元中，觀察神經(jīng)元凋亡的變化，以闡明小膠質細胞TLR9激活對神經(jīng)元的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

BV-2細胞由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院唐亞梅研究員饋贈；C57新生24 h小鼠購自中山大學東校區(qū)動物中心。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25 %胰酶、神經(jīng)元Neurobasal培養(yǎng)基、B27、小鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗體(Abcam)；594驢抗兔Ⅱ抗(Jackson)；X-tremeGENE siRNA轉染試劑(Roche)； BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德公司)；小鼠cleaved caspase-3蛋白單克隆抗體和GAPDH蛋白單克隆抗體(CST)；TUNEL 試劑盒(Merck)。TLR9 siRNA序列由上海吉瑪公司設計合成。

細胞培養(yǎng)箱(Heraus)；細胞缺氧培養(yǎng)箱(New Brunswick Scientiflc)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；多功能酶標儀(Labsystems)； PAC200型電泳電源、垂直電泳槽、水浴式電轉印跡裝置(Bio-Rad)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene)。

2 實驗方法

2.1 BV-2細胞培養(yǎng) BV-2細胞接種于含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化傳代，3～5 d傳代1次。至細胞生長良好時開始實驗。用于實驗的細胞代數(shù)為5～15代。

2.2 原代大腦皮層神經(jīng)元分離培養(yǎng)與鑒定 將新生(24 h內)C57小鼠，在無菌條件下將小鼠斷頭，取腦，仔細剝除腦膜，將皮質剪成小塊，用0.125%胰酶消化，并加入少量DNase Ⅰ，用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，反復吹打細胞懸液。將細胞懸液分別過200目及400目細胞篩，加入含10%血清的神經(jīng)元培養(yǎng)基(neurobasal+2% B27+1% 谷氨酰胺)重懸細胞，細胞計數(shù)，調整細胞密度為5×108/m2，接種于預先用L-多聚賴氨酸包被的孔板中，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中。4 h后待細胞貼壁后更換為不含血清的神經(jīng)元培養(yǎng)基，之后隔3 d半量換液。待神經(jīng)元細胞生長5～7 d后，進行免疫熒光技術鑒定，NSE 抗體(1∶200)標記神經(jīng)元，顯微鏡下觀察，計算神經(jīng)元細胞陽性率。

2.3 實驗分組 按添加至經(jīng)OGD處理4 h的神經(jīng)元中的BV-2細胞培養(yǎng)上清液的不同分為6組：(1)正常BV-2組：BV-2細胞正常培養(yǎng)后的上清液；(2)NC-siRNA組：BV-2細胞轉染 negative control siRNA(NC-siRNA)并培養(yǎng)24 h的上清液；(3)TLR9-siRNA組：BV-2細胞轉染TLR9-siRNA并培養(yǎng)24 h的上清液；(4)OGDR組：BV-2細胞OGD 4 h并復氧培養(yǎng)24 h的上清液；(5)OGDR+NC-siRNA組：BV-2細胞OGD 4 h并轉染NC-siRNA復氧培養(yǎng)24 h的上清液；(6)OGDR+TLR9-siRNA組：BV-2細胞OGD 4 h并轉染TLR9-siRNA復氧培養(yǎng)24 h的上清液。此外，另設1組神經(jīng)元對照組，不添加BV-2細胞上清。

2.4 OGDR處理BV-2細胞和原代皮層神經(jīng)元 把BV-2細胞以合適密度分別接種于6孔板，待其生長至60～70%，將正常培養(yǎng)基換成EBSS平衡鹽溶液，置于缺氧培養(yǎng)箱中，37 °C、5% CO2、1% O2培養(yǎng)4 h。OGDR組BV-2細胞OGD 4 h后從缺氧培養(yǎng)箱中取出細胞，更換成正常培養(yǎng)基，恢復正常條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。OGDR+NC-siRNA組、OGDR+TLR9-siRNA組BV-2細胞于OGD結束后更換成正常培養(yǎng)基同時加入已混勻的轉染復合物。

神經(jīng)元原代培養(yǎng)7 d后，將正常培養(yǎng)基換成DMEM無糖培養(yǎng)基，置于缺氧培養(yǎng)箱中，37 °C、5% CO2、1% O2培養(yǎng)4 h，復氧并分別添加(1)～(6)組BV-2細胞上清，神經(jīng)元對照組作為對照組不添加BV-2細胞上清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后行TUNEL和Western blotting檢測。

2.5 BV-2細胞的TLR9基因沉默 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，接種于6孔板, 加入不含抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 使細胞生長穩(wěn)定并達到30%～50%的細胞貼壁融合。根據(jù)前期研究的結果[5]，選取對BV-2細胞TLR9表達抑制效果最大的siRNA-1549序列作為本實驗的TLR9干擾序列。參照X-tremeGENE siRNA轉染試劑說明書，將轉染試劑分別與相應劑量TLR9-siRNA、NC-siRNA混勻形成轉染復合物，將轉染復合物200 μL加入6孔板，與2 mL細胞培養(yǎng)基混勻后放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用實時熒光定量PCR檢測siRNA干擾效率。干擾序列：siRNA-1549上游 5’-GGAACAACCUGGUGACUAUTT-3’，下游 5’-AUAGUCACCAGGUUGUUCCTT-3’);NC-siRNA 上游 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2.6 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 各組神經(jīng)元經(jīng)上述處理24 h取樣，采用TUNEL試劑盒，參照說明書操作。熒光顯微鏡下觀察，比較凋亡小體(綠染)與總細胞數(shù)，計算細胞凋亡率，比較各組差異。

2.7 Western blotting 檢測神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白的水平 各組神經(jīng)元經(jīng)上述處理24 h后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以GAPDH為內參照，12% SDS-PAGE分離蛋白后，電轉法將目的蛋白轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h ，分別加入I抗(1∶1 000 cleaved caspase-3抗體，1∶1 000 GAPDH抗體)，4 °C孵育過夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，化學發(fā)光法顯色。采用Quantity One分析軟件對目的蛋白條帶與GAPDH灰度值的比值進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，進一步采用LSD法兩兩比較。部分不符合正態(tài)性、方差齊性數(shù)據(jù)采用校正t檢驗或秩和檢驗。用SPSS 13．0軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 原代神經(jīng)元分離培養(yǎng)細胞形態(tài)

1.1 形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下可見分離培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元分散種植，6 h細胞貼壁，呈圓形或橢圓；24 h可見神經(jīng)元細胞突起；48 h細胞變成錐形或梭形；72 h神經(jīng)元胞體變大，突起變長，與鄰近神經(jīng)元胞體或突起連接，形成網(wǎng)絡；7 d神經(jīng)元胞體增大，突起增多變長，見圖1。

1.2 免疫熒光鑒定 神經(jīng)元培養(yǎng)5～7 d后熒光顯微鏡下可見NSE標記陽性神經(jīng)元細胞胞體及軸突均染成紅色(圖1)，陽性率在96%以上。

Figure 1.A: morphological image of the cultured neurons from the brain cortex of newborn C57 mice； B: the neurons were stained with neuron-specific enolase (red) and nuclei were counterstained with DAPI (blue). The scale bar=50 μm.

1.3 OGDR后BV-2細胞和原代神經(jīng)元的形態(tài)變化 正常培養(yǎng)BV-2細胞單層生長，細胞體呈細長或橢圓，從胞體發(fā)出細長而有分支的突起，表面有許多小棘突，胞體飽滿，細胞間相互交織成簇狀，處于靜止狀態(tài)。OGD 4 h恢復正常培養(yǎng)前(即OGDR 0 h)，細胞數(shù)量減少，貼壁細胞變小、變圓，部分細胞皺縮，細胞突觸消失，細胞之間連接消失； OGDR 24 h，細胞體變?yōu)闄E圓，分支變細長，細胞分裂，數(shù)量變多，見圖2。

神經(jīng)元OGDR 0 h部分神經(jīng)元胞體皺縮，折光性下降，出現(xiàn)空泡樣變，軸突變細、扭曲、斷裂。OGDR 24 h大部分神經(jīng)元腫脹、胞膜破裂、折光性消失、胞核固縮碎裂、軸突變細變短斷裂，見圖2。

Figure 2.The morphologic changes of BV-2 cells and primary neurons after OGDR. The scale bar=50 μm.

2 BV-2細胞TLR9基因沉默效果

經(jīng)序列siRNA-1549和NC-siRNA處理24 h， BV-2細胞TLR9的mRNA相對表達水平分別為0.22±0.05和0.95±0.04，使TLR9 mRNA表達于24 h降低77.89%(P<0.05)，而NC-siRNA與對照組無統(tǒng)計學差異，說明TLR9-siRNA能有效抑制TLR9基因的表達。

3 神經(jīng)元凋亡檢測結果

熒光顯微鏡下可見，神經(jīng)元對照組外的其余6組NSE染色顯示大部分神經(jīng)元胞體邊界不清，軸突消失，周圍大片紅色淡染，與DAPI分布一致，極少數(shù)神經(jīng)元仍保留正常結構；神經(jīng)元對照組NSE染色更淡， 可見部分DAPI染色核碎裂。TUNEL染色各組均可見綠染凋亡小體。7組凋亡率分別為3.27%、14.23%、18.93%、11.50%、8.17%、6.73%和1.00%，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The neurons were stained with neuron-specific enolase (NSE, red), nuclei were counterstained with DAPI (blue) and apoptosis were detected by TUNEL (green). The scale bar=50 μm.

4 神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白表達的變化

與神經(jīng)元對照組比較，其余6組cleaved caspase-3蛋白水平均增高(P<0.05)。NC-siRNA組clcaved caspase-3蛋白水平較正常BV-2組增高(P<0.05)，與TLR9-siRNA組比較無明顯變化(P>0.05)。OGDR組cleaved caspase-3蛋白水平較正常BV-2組增高(P<0.05)，與OGDR+NC-siRNA組比較無明顯變化(P>0.05)。與OGDR+TLR9-siRNA組比較，TLR9-siRNA組、OGDR組和OGDR+NC-siRNA組cleaved caspase-3蛋白水平均增高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The protein level of cleaved caspase-3 in the neurons with different treatments determined by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal BV-2 group; &P<0.05 vs NC-siRNA group; #P<0.05 vs TLR9-siRNA group; △P<0.05 vs OGDR group; ▲P<0.05 vs OGDR+NC-siRNA group; ＄P<0.05 vs OGDR+TLR9-siRNA group.

討 論

在既往的體內外實驗中，我們已發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注或OGDR后小膠質細胞TLR9被激活[3-4]。本研究采用RNA干擾技術，觀察到OGDR后小膠質細胞TLR9基因沉默能減輕神經(jīng)元凋亡,降低神經(jīng)元caspase-3蛋白的表達。

為了明確小膠質細胞TLR9激活對神經(jīng)元存活的作用，避免神經(jīng)細胞間的相互作用對結果的影響，本研究對小膠質細胞和神經(jīng)元分別進行培養(yǎng)。OGD 4 h后神經(jīng)元呈缺血缺氧性損傷改變，恢復氧葡萄糖供應24 h后神經(jīng)元損傷部分恢復，出現(xiàn)凋亡。而加入不同處理的BV-2細胞上清后，神經(jīng)元損傷均加重，凋亡率增加，cleaved caspase-3蛋白水平上調。說明BV-2細胞分泌的物質對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。其中OGDR組比正常BV-2組神經(jīng)元損傷更為嚴重，表明OGDR處理可促使BV-2細胞分泌更多的有害物質。對OGDR處理的BV-2細胞TLR9進行RNA干擾后，神經(jīng)元的凋亡率降低，cleaved caspase-3蛋白水平上調被抑制。這些結果進一步說明OGDR后BV-2細胞TLR9的激活可能是導致神經(jīng)元損傷的一個重要原因。

TLR9作為TLRs家族中是唯一識別DNA的成員，位于胞漿的內質網(wǎng)膜上，細胞激活后，TLR9被傳遞至內吞溶酶體，并于此處啟動配體識別和后續(xù)的信號轉導[6-7]。TLR9的配體為含非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸序列的DNA[cy-tosinephosphate-guanine-containing oligodeoxynucleotide (ODN)-DNA, CpG-DNA]。TLR9被激活后，可通過轉錄因子核因子κB(nuclear factor kappa B， NF-κB)或干擾素調節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)途徑，誘導促炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)或細胞保護因子干擾素β(interferon β，IFN-β)等的產(chǎn)生，在炎癥免疫反應中發(fā)揮重要作用[8-9]。在另一體外實驗中，我們觀察到OGDR后BV-2細胞TLR9、NF-κB(p-p65)、p-IRF-7、TNF-α和IL-1β蛋白表達上調，而NF-κB(p65)、IRF-7和IFN-β蛋白表達無顯著變化。這些結果表明OGDR后小膠質細胞TLR9信號通路的活化以促炎途徑為主。本研究發(fā)現(xiàn)OGDR后小膠質細胞TLR9基因沉默能減輕神經(jīng)元的損傷，其機制可能為抑制了TLR9的下游炎癥因子的分泌。

本實驗中單純TLR9-siRNA轉染組細胞上清處理后神經(jīng)元的cleaved caspase-3蛋白水平反而較其余各組升高，凋亡增加，原因可能與上述TLR9能介導促炎癥和細胞保護2條信號通路有關。既往研究顯示，給予細胞TLR9配體CpG-DNA的預處理，誘導適當細胞因子的產(chǎn)生和炎癥反應可使神經(jīng)元缺血再灌注損傷減少[10-11]。而單純沉默TLR9后，此種神經(jīng)保護作用可能消失，反而加重了神經(jīng)元的凋亡。OGDR+TLR9-siRNA組較OGDR組神經(jīng)元凋亡減少，OGD處理與預處理不同，可能誘導TLR9參加促炎癥因子而加重神經(jīng)元損傷，抑制TLR9可減輕神經(jīng)元損傷。此外，正常BV-2組與NC-siRNA轉染組、OGDR組與 OGDR+NC-siRNA組之間的cleave caspase-3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義，說明本實驗中轉染操作本身并不增加對神經(jīng)元的損傷，排除了轉染因素對實驗結果的影響。

綜上所述，本研究模擬腦缺血再灌注的體內過程，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)小膠質細胞TLR9的激活加重神經(jīng)元的缺血缺氧損傷，而沉默TLR9基因對神經(jīng)元起保護作用。進一步的研究還需明確小膠質細胞TLR9的激活加重神經(jīng)元損傷的機制。

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Inhibition of Toll-like receptor 9 activation in microglia after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation protects neurons from damage

PENG Qing-xia1, YANG Bi-ying2, PAN Jing-rui1, WANG Hong-xuan1, LI Xiang-pen1, WANG Yi-dong1

(1DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,2TheForthDepartmentofNeurology,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China.E-mail:wydys@126.com)

AIM: To observe the Toll-like receptor 9 (TLR9) activation in microglia BV-2 cells after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGDR), and its effects on neuronal apoptosis. METHODS: The BV-2 cell supernatants were collected after the corresponding treatment and added to mouse primary cortical neurons after OGDR for 4 h, followed by normal culture for 24 h. The cells were divided into normal BV-2 group, NC-siRNA group, TLR9-siRNA group, OGDR group, OGDR+NC-siRNA group, OGDR+TLR9-siRNA group and control group (without adding BV-2 cell supernatant). The changes of the neuronal morphology were observed under an inverted phase- contrast microscope, and the neuronal apoptosis was detected by TUNEL. The protein expression of cleaved caspase-3 was detected by Western blotting. RESULTS: After OGDR, the axon turned thin, twisted and broken, and neuronal swelling, decrease in refraction and vacuolar degeneration were observed. The green-stained apoptotic bodies in the neurons in all groups were positive. Compared with control group, the caspase-3 protein levels in other groups were increased. Compared with the normal BV-2 group, the caspase-3 protein in OGDR group and TLR9-siRNA group was increased. Compared with OGDR+TLR9-siRNA group, the caspase-3 protein in TLR9-siRNA group and OGDR group was decreased. CONCLUSION: After OGDR, TLR9 activation in BV-2 cells induces neuronal apoptosis with the increase in caspase-3 protein level. Inhibition of TLR9 expression reduces neuronal damage.

Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation; Microglia; Neurons; Toll-like receptor 9

1000- 4718(2015)03- 0403- 06

2014- 10- 28

2014- 12- 19

國家自然科學基金資助項目(No. 81171103)；廣東省自然科學基金資助項目(No. S2011010006043)

△通訊作者 Tel: 020-81332619； E-mail： wydys@126.com

R743; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.004