熊麗輝+孫大中

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.22.3

摘要目的：研究生脈飲對病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡作用的影響。方法：用柯薩奇B病毒建立感染的心肌細(xì)胞模型，在感染后24小時將細(xì)胞分為正常對照組、病理模型組、生脈飲組和輔酶Q10組。4組分別在不同時間點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。結(jié)果：在48小時點(diǎn)開始檢測，正常對照組無細(xì)胞凋亡，生脈飲組及輔酶Q10組均有凋亡，生脈飲組凋亡率低于輔酶Q10組（P<0.05），病理模型組隨著時間的推移，凋亡率增加，72小時點(diǎn)明顯高于48小時點(diǎn)（P<0.01），與藥物干預(yù)組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：生脈飲能夠有效抑制病毒性心肌炎心肌細(xì)胞的凋亡，且應(yīng)該早期干預(yù)。

關(guān)鍵詞生脈飲；病毒性心肌炎；細(xì)胞凋亡

Study on the apoptosis effect of pulse-activating decoction compound preparation in viral myocarditis

Xiong Lihui1，Sun Dashan2

Basic Medical Colleg，Changchun Traditional Chinese Medicine University，1301171

2012 Grade Traditional Chinese medicine Professional Experimental Class，Guangzhou Traditional Chinese Medicine University（Guangzhou City，Guangdong），1301172

AbstractObjective：To study the effect of pulse-activating decoction compound preparation in myocardial apoptosis effect of viral myocarditis.Methods：Using coxsackie B virus established infectious myocardial cell model.In 24 hours after infection，the cells were divided into four groups：the normal control group，the pathological model group，the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group.The cellular morphology of four groups of cells were observed at different time points.The apoptosis was detected by TUNEL method.Results：Begin testing at 48 hours，the normal control group had no apoptosis；the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group all had apoptosis；the apoptosis rate of the pulse-activating decoction group was lower than that of the coenzyme Q10 group（P<0.05）.In the pathological model group，the apoptosis rate was increased as time goes on.72 hours point was obviously higher than 48 hours point（P<0.01）.There had statistically significant compared with the drug intervention group （P<0.05）.Conclusion：Pulse-activating decoction can effectively inhibit the myocardial cell apoptosis of viral myocarditis，and it should be early intervented.

Key wordsPulse-activating decoction；Viral myocarditis；Apoptosis

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是指病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的急慢性炎性病變，多由柯薩奇病毒引起。在柯薩奇病毒導(dǎo)致VM的病理機(jī)制研究中，越來越多的證據(jù)表明，柯薩奇病毒導(dǎo)致病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡，從而出現(xiàn)心肌壞死病變[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為VM屬于“心悸”“怔忡”范疇，病機(jī)中多存在氣陰兩虛，治療上以益氣養(yǎng)陰為主，多采用生脈飲進(jìn)行加減治療，其組成為人參、麥冬、五味子。生脈飲治療VM臨床療效確切，但其干預(yù)機(jī)制尚不明確，且臨床上生脈飲是否應(yīng)該早期應(yīng)用一直是臨床爭議的問題。為此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察生脈飲對VM心肌細(xì)胞凋亡的影響，力求明確生脈飲的作用機(jī)制以及最佳時間，為臨床準(zhǔn)確使用提供參考。

資料與方法

材料：①實(shí)驗(yàn)動物：新生SD（Sprague-Dawlay）大鼠，1～3日齡，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。②病毒株：柯薩奇B病毒試劑盒（Coxsackie Virus B3）。③實(shí)驗(yàn)藥物：生脈飲注射液，輔酶Q10注射液，胰蛋白酶（1：250），Sigma；DMEM（dulbecs modified eagle）培養(yǎng)基，GIBCO；胎牛血清，GIBCO；牛血清白蛋白，GIBCO。④溶液配制：緩沖液：Na2HPO4·2H2O 0.06 g，KH2PO4 0.06 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，葡萄糖1.00 g，NaCl 8.00 g，KCl 4 g，CaCl2 0.14 g，三蒸水1 000 mL。DMEM培養(yǎng)液：20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素及谷氨酰胺。細(xì)胞消化液：由Ⅰ型膠原酶20 mg、胰蛋白酶18 mg、牛血清白蛋白10 mg、加Eagle培養(yǎng)基10 mL。

方法：①心室肌細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠打開胸腔，取出心室肌，放入緩沖液中洗滌，剪取心室肌組織經(jīng)胰酶37℃水浴消化10分鐘后，1000 rpm離心，反復(fù)數(shù)次，收集沉淀的細(xì)胞。按照細(xì)胞懸液5×106/mL密度種植于96孔板，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②CVB3感染心室肌細(xì)胞：大約72小時后，光鏡下觀察細(xì)胞已貼壁，將CVB3病毒株作連續(xù)10倍稀釋，接種于96孔板心室肌細(xì)胞，1小時后，棄去病毒液，加入培養(yǎng)液。③生脈飲干預(yù)：病毒感染24小時后，分別加入藥物進(jìn)行干預(yù)。生脈飲干預(yù)組：每天加生脈飲、100TCID50CVB3、DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)；輔酶Q10組：每天加輔酶Q10、100TCID50CVB3、DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)；病理模型組：每天加100TCID50CVB3 + DMEM；正常對照組：常規(guī)細(xì)胞液培養(yǎng)。④心肌細(xì)胞形態(tài)觀察：心肌細(xì)胞采用蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下在不同時間點(diǎn)觀察每組細(xì)胞形態(tài)，尤其注意觀察細(xì)胞壞死及細(xì)胞凋亡情況。⑤心肌細(xì)胞存活率的檢測：MTT（用PBS將MTT配成5 mg/mL溶液）比色法測定細(xì)胞存活率。⑥心肌細(xì)胞凋亡率的檢測：采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。將細(xì)胞預(yù)處理后，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。染色后，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。方法是隨機(jī)選擇5個高倍視野（40×10），計算每個視野陽性心肌細(xì)胞數(shù)的比例，取平均值，計算心肌細(xì)胞凋亡百分率。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，用t檢驗(yàn)進(jìn)行各數(shù)值之間的分析比較。

結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞培養(yǎng)大約72小時后，顯微鏡下觀察，心肌細(xì)胞成簇分布，并規(guī)律成片搏動，表明心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功。病毒接種后24小時，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，逐漸有扁縮，搏動減弱；48小時點(diǎn)，生脈飲干預(yù)組、輔酶Q10組、病理模型組細(xì)胞變扁縮情況增多，以病理模型組最為明顯；正常對照組細(xì)胞生長良好，數(shù)量進(jìn)一步增多，滿布視野。72小時點(diǎn)，生脈飲干預(yù)組、輔酶Q10組、病理模型組開始出現(xiàn)細(xì)胞有脫落，病理模型組有明顯的細(xì)胞壞死；生脈飲干預(yù)組、輔酶Q10組細(xì)胞壞死不明顯，生脈飲組細(xì)胞形態(tài)較24小時點(diǎn)有所恢復(fù)；正常對照組細(xì)胞生長良好，數(shù)量無增加。

細(xì)胞存活率：在72小時點(diǎn)，正常組細(xì)胞存活率100%。病理對照組隨著時間的延長，存活率明顯下降，72小時點(diǎn)存活率不足50%；生脈飲干預(yù)組存活率仍>75%，輔酶Q10組細(xì)胞存活率明顯下降，大約60%。

細(xì)胞凋亡率，見表1。

討論

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中，由于受到某些因素的影響，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡參與了體內(nèi)多種病理過程，與疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，亦與病毒性心肌炎的發(fā)生相關(guān)[2]。CVB3病毒感染心肌后，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，引起心肌細(xì)胞病變，進(jìn)而形成心功能障礙[3]。

本研究從細(xì)胞形態(tài)、存活率及細(xì)胞凋亡3個方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，柯薩奇病毒B導(dǎo)致心肌細(xì)胞變形、壞死，并逐步發(fā)生細(xì)胞凋亡。病理模型組，隨著時間的推移，凋亡發(fā)生增加，而正常對照組在72小時未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。生脈飲主要成分為人參、麥冬和五味子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，藥理研究表明具有抗氧化的能力，保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮了對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。由于生脈飲的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，我們認(rèn)為早期應(yīng)用生脈飲效果更佳，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在感染后24小時用生脈飲對感染的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，在48小時點(diǎn)凋亡的減少不明顯，而72小時則減少明顯，說明免疫調(diào)節(jié)的發(fā)生需要一定的時間。臨床應(yīng)早期使用生脈飲為佳。

參考文獻(xiàn)

[1]黎帆，余克花，莫冰，等.川芎嗪對CVB3感染小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，50（4）：14-16.

[2]曹蕾，林佳，王瑧，等.雷公藤甲素對病毒性心肌炎細(xì)胞凋亡及Fas/FasL蛋白表達(dá)的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，（9）： 1636-1638.

[3]Yin XC，Peng YH，Xiao ZX.Mechanism of Fas/FasL signal transduction pathway in K562 cell apoptosis induced by diallyl disulfide[J].Journal of Experimental Hematology， 2011，19（3）：634-637.