鄧鵬程，王岐本，鄺滿元，徐 松

(湘南學院基礎(chǔ)醫(yī)學部解剖教研室，湘南郴州 423000)

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環(huán)介導等溫擴增法在常見性病病原體檢測中的應用*

鄧鵬程，王岐本，鄺滿元，徐 松

(湘南學院基礎(chǔ)醫(yī)學部解剖教研室，湘南郴州 423000)

環(huán)介導等溫擴增法； 常見性?。?病原體檢測

20世紀70年代后期,性病在我國一些地區(qū)死灰復燃,發(fā)病地區(qū)不斷擴大,發(fā)病人數(shù)直線上升,危害日益嚴重,從沿海到內(nèi)地,從城市到農(nóng)村,從社會到家庭,性病疫情逐步擴散蔓延。據(jù)2002年全國對7種常見性?。悍橇芫阅虻姥?、尖銳濕疣、生殖器皰疹、梅毒、淋病、軟下苷、性病淋巴肉芽腫累計報道為 744 848例，發(fā)病率為58.15/10萬。另外由于各種原因的漏診和漏報，中國疾病預防控制中心性病麻風病防治中心的調(diào)查結(jié)果顯示，性病實際發(fā)病數(shù)是報告數(shù)的10～20倍。世界衛(wèi)生組織估計，我國每年實際新發(fā)性病例數(shù)為1 600～2 000萬[1]。近十幾年來，中國性病發(fā)病率每年以20%至30%速度增加，性病已成為五大傳染病之一,給社會和人民都帶來了嚴重的危害。為防治和控制性傳播疾病,對性病病原體的準確快速檢測意義重大。傳統(tǒng)的性病檢測法大多繁瑣費時，不利于性病的早期診斷以及及時控制，因此開發(fā)一系列能應用于基層醫(yī)療機構(gòu)的性病病原體檢測方法成為當務之急。近年來發(fā)展的環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)因為具有特異、敏感及操作簡便等特征已用于各種病原體的檢測。本研究探討LAMP在常見性病病原體檢測中的可行性及應用前景進行分析，報道如下。

1 傳統(tǒng)的性病病原體檢測法

1.1 涂片鏡檢法 涂片鏡檢法一般是直接將各種分泌物及體液標本涂片后，通過革蘭染色或巴氏染色后進行顯微鏡下觀察判定。該方法簡單、易操作，成本低，對實驗要求不高，多用于男性急性淋病的診斷。女性宮頸和陰道中雜菌很多，有的雜菌很像淋球菌，給診斷造成困難，出現(xiàn)較高的假陽性率。針對沙眼衣原體的檢查，常用姬姆薩染色法和碘染色法，但敏感性不高。更重要的是此方法對醫(yī)生的經(jīng)驗要求較高,鏡檢結(jié)果以主觀判斷為主,容易造成誤診和漏診,檢測結(jié)果陽性率不高,特別是在基層醫(yī)院很難較好地應用[2]。

1.2 免疫學檢測法 20世紀80年代以來，免疫學檢測法廣泛運用于性病檢測中，其基本原理是將某種發(fā)光劑或其衍生物加入到一個免疫反應體系中，在酶的催化作用下發(fā)光，可以根據(jù)發(fā)光強度來計算待測抗原或抗體的量。加入發(fā)光增強劑后，持續(xù)時間延長，可以重復測量，方法靈敏、準確。如何紅霞等[3]以人工合成的人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 gp41.1(sp1)等5條多肽,采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)原理建立檢測抗HIV-1P2總抗體的雙抗原夾心ELISA。該實驗通過檢測衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供質(zhì)控參比血清,發(fā)現(xiàn)其特異性和靈敏度均為100%。其優(yōu)點是特異性強、敏感性高,操作簡便快捷,適合于獻血者大范圍篩選，缺點是免疫學檢測方法在新感染或未產(chǎn)生高抗體滴度的人群中敏感性較低，IgG基因突變可影響檢出率，IgG抗體產(chǎn)生的延遲性會影響早期診斷和及時治療。

1.3 聚合酶鏈反應(PCR) 20世紀90年代以后，隨著分子生物學檢測方法的發(fā)展，性病病原體的各種分子生物學檢測方法也應運而生，主要方法有：PCR、連接酶鏈反應技術(shù)基因芯片、Gene Chip技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等。其中PCR應用較為廣泛，PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。隨著微生物基因組學的發(fā)展,PCR在感染性疾病檢測和診斷中的應用日趨廣泛,特別是在致病微生物，如病毒、細菌、衣原體、支原體、螺旋體等引起的性病感染DNA 檢測應用較廣。PCR檢測技術(shù)較之傳統(tǒng)方法有許多優(yōu)點,但其費用昂貴、易受污染，其假陽性尤其是一個主要需要考慮的問題。由于需要昂貴的PCR等儀器和高技術(shù)要求，該技術(shù)在基層醫(yī)療機構(gòu)尚未開展病原體的核酸檢測。

總之，目前臨床針對性病病原體傳統(tǒng)檢測方法既有優(yōu)勢，也有許多不足，而在此基礎(chǔ)上開發(fā)針對性病病原體的快速且準確的檢測方法對防治和控制我國日益嚴重的性傳播疾病意義重大。

2 LAMP在性病病原體檢測中的應用

2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的基因診斷技術(shù)，即LAMP中文名為“環(huán)介導等溫擴增反應”，受到了世界衛(wèi)生組織、各國學者和相關(guān)政府部門的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應用于嚴重急性呼吸道綜合征、禽流感、艾滋病等疾病的檢測中。LAMP具有以下幾個優(yōu)勢：(1)等溫高效。相比于常規(guī)PCR利用高溫使雙螺旋解鏈變性成單鏈進行熱循環(huán)，NASBA和3SR則使用一系列轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過程來循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內(nèi)切酶和修飾過的模板來循環(huán)擴增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測并擴增小于10個拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點。技術(shù)要求、材料儀器要求、技術(shù)本身特異性缺陷等方面嚴重束縛了這些技術(shù)的推廣應用。LAMP則在這些方面有所突破。(2)有較高的特異性和抗干擾能力。當2對引物與目的基因片段的6個區(qū)域匹配上就能進行擴增。非目的基因片段對LAMP反應的干擾比小，這方面比PCR強。LAMP的反應體系比較穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定并且對于樣品中原有或污染的干擾基因片段仍然不敏感，而其他反應體系則無法做到這一點。(3)敏感性較高。可以以單拷貝的基因為模板進行擴增。(4)反應過程簡單快速且高效。能夠在1 h內(nèi)將單拷貝的基因模板擴增到109個拷貝，這一過程是在60～70 ℃的恒溫下進行的。只需一臺恒溫箱即可,不需受昂貴儀器的束縛。另外LAMP結(jié)果的檢測也無需儀器，這些在一定程度上降低了實驗的操作成本。只要引物設(shè)計正確，并且完善各種反應條件之后，LAMP對于樣品處理、操作技術(shù)和儀器設(shè)備的要求都比較低，在野外工作時也能達到。

隨著LAMP的發(fā)展，它已成功應用于細菌、病毒、支原體、真菌、寄生蟲、乙型肝炎病毒檢測等[4]。最近，國內(nèi)、外專家也將其應用于各種性病病原體的檢測當中。

2.1 LAMP在艾滋病病毒檢測中的建立 2009年Hosaka等[5]利用RT-LAMP對HIV-1M組進行檢測，在60 ℃的等溫條件下，擴增反應在35 min內(nèi)即可完成，其檢測限可以達到120 copy/mL。該試驗對從艾滋病高發(fā)區(qū)——西非的喀麥隆所收集的57例感染HIV-1的患者和40例未感染HIV-1的居民體內(nèi)血漿樣本進行RT-LAMP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，57例感染HIV-1的患者血漿樣本中有56例帶有HIV-1M組的血樣本，例如圖標類型A、B、G、F2,以及循環(huán)重組形式(CRFs)_01、_02、_09、_11、_13都被檢測為陽性。針對一個帶有HIV-10組及40例未感染HIV-1的血漿樣本分別進行檢測，結(jié)果皆顯示為陰性。這些發(fā)現(xiàn)證明了RT-LAMP對血漿樣本中含有的HIV-1M RNA的檢測快速且靈敏，而且具有特異性。這些數(shù)據(jù)也說明了LAMP在艾滋病病毒的診斷中是可行的，特別適宜于資源條件不足的環(huán)境。

2.2 LAMP在淋球菌檢測中的建立 崔亞利等[6]利用 Primer Explorer V3軟件分別針對淋球菌porA及16S rRNA基因設(shè)計2條內(nèi)引物 FIP、BIP，2條外引物F3、B3，2條環(huán)引物LF、LB，共6條引物，以淋球菌標準菌株基因組DNA為模板，進行LAMP擴增。同時，以外引物F3、B3 為PCR引物，進行PCR擴增，并比較兩種擴增方法的靈敏度和特異性，探討LAMP用于淋球菌感染早期診斷的可行性。他們經(jīng)過試驗得出結(jié)果：LAMP 與PCR靈敏度相同，可檢測到10個拷貝的目的基因；其針對淋球菌porA和16S rRNA基因的引物對腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌和大腸埃希菌的 DNA均不能擴增，其試驗成功建立了檢測淋球菌 porA和16SrRNA基因的LAMP。他們認為與PCR相比，LAMP不需要使用PCR儀等昂貴、精密的儀器設(shè)備，避免了DNA的熱變性，長時間的溫度循環(huán)，一級產(chǎn)物后續(xù)檢測等步驟，更為快速，且操作簡便，檢測成本更低，為淋球菌的快速檢測提供了新的手段，有望成為淋球菌常規(guī)檢測的簡便方法。

2.3 LAMP在沙門菌檢測中的建立 沙門菌病也屬于一種常見的性病，葉宇鑫等[7]以沙門桿菌為研究對象,探討了將原位熒光LAMP應用于檢測沙門菌所需要的具體實驗方法與數(shù)據(jù),成功將原位熒光LAMP應用于檢測人工污染食品中的沙門菌。該試驗選取invA基因作為靶序列設(shè)計了2對引物進行LAMP擴增。結(jié)果顯示，與PCR相比,LAMP擴增無需破碎細胞提取DNA,操作簡便，反應過程耗時少;反應條件恒溫便可,基因檢測水平證明LAMP擴增產(chǎn)物高度特異性;根據(jù)反應結(jié)果顏色變化肉眼便可作出判斷。

3 LAMP在性病病原體檢測中的應用展望

與傳統(tǒng)性病病原體檢測法相比，LAMP具有明顯優(yōu)勢。首先，LAMP經(jīng)濟實用，不需要昂貴的PCR儀，對于中、小醫(yī)院只需要一臺恒溫水浴箱即可。其次，LAMP最大的優(yōu)勢就在于操作的簡便性及對儀器設(shè)備和人員要求不高，人員只需簡單培訓即可，最適合基層醫(yī)院和場外應用。LAMP操作步驟簡單，只需按反應體系要求加入反應液、酶、引物及模板于PCR管中，于恒溫箱反應45 min左右，經(jīng)肉眼觀察反應管顏色是否變?yōu)榘咨珳啙峋湍芘袛嘟Y(jié)果。另外，LAMP高效快速,LAMP不需要擴增產(chǎn)物雙鏈DNA熱變性，避免了溫度循環(huán)從而節(jié)省大量時間，核酸在1 h內(nèi)便可完成擴增，從而快速檢測到擴增產(chǎn)物，在性病檢測中應用能達到快速診斷的目的。與免疫學檢測方法相比，LAMP能更為精準，因為其能擴增出病原體基因的特異性梯狀條帶。與涂片鏡檢法相比，LAMP省時省力、不易漏診、檢測結(jié)果更具客觀性。如果研發(fā)相關(guān)性病基因檢測試劑盒，LAMP有望成為性病常規(guī)檢測的簡便方法，為基層醫(yī)院進行性病檢測創(chuàng)造有利條件，同時為患者提供快速、準確的檢測，在防治與控制性疾病的傳播中發(fā)揮重要作用。

[1]張紅兵，李琦，馬駿，等．我國性病流行現(xiàn)狀及應對措施[J]．中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2004，27(6)：377-380．

[2]何江，仇東輝，余伍忠，等．性傳播疾病實驗檢測綜述[J]．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2004，12(5)：139-140．

[3]何紅霞，貌盼勇，侯俊，等．雙抗原夾心法檢測抗HIV-1/2總抗體方法的建立和評價[J]．中華實驗和臨床病毒學雜志，2002，16(3)：288-291．

[4]張如勝，魏泉德．LAMP技術(shù)在病原微生物檢測中的應用[J]．華南預防醫(yī)學，2007，33(5)：45-49．

[5]Hosaka N,Ndembi N,Ishizaki A,et al.Rapid detection of human immunodeficiency virus type 1 group M by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay[J].J Virol Methods,2009,157(2):195-199.

[6]崔亞利，何於娟，劉鑫，等．快速檢測淋球菌porA和16S rRNA基因的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的建立[J]．中國生物制品學雜志，2010，23(10)：1125-1128．

[7]葉宇鑫，李琳，山崎伸二，等．原位熒光LAMP技術(shù)檢測食源性沙門氏菌[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(3)：137-142．

湖南省高等學校2010年科學研究項目(10C1240)。

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