吳榮強(qiáng)，王蘇建，王仕忠，周?？。荽航?/p>

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213003; 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003)

β-葡聚糖對(duì)單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-8和IL-12的影響

吳榮強(qiáng)1，王蘇建1，王仕忠2，周?？?，戚春建2

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213003; 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003)

目的研究β－葡聚糖對(duì)單核細(xì)胞釋放動(dòng)脈粥樣硬化致病因子[腫瘤壞死因子α(TNF－α)、白細(xì)胞介素18(IL－8)和白細(xì)胞介素12(IL－12)]的影響。方法用密度梯度離心法分離健康志愿者新鮮血液中的單核細(xì)胞，使用佛波醇酯(PMA)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步利用氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為無(wú)藥對(duì)照組、ox－LDL組、顆粒性β－葡聚糖(WGP)組和WGP+ox－LDL組，提取總RNA，擴(kuò)增TNF－α、IL－8和IL－12 cDNA，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定細(xì)胞上清液中的濃度。結(jié)果與無(wú)藥對(duì)照組比較，ox－LDL誘導(dǎo)單核細(xì)胞TNF－α、IL－8和IL－12蛋白水平的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，而WGP可以顯著抑制ox－LDL誘導(dǎo)的上述細(xì)胞因子在蛋白水平和TNF－α、IL－8在mRNA水平的表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論β－葡聚糖可能通過(guò)抑制單核細(xì)胞促炎因子的分泌減緩動(dòng)脈粥樣硬化形成。

β－葡聚糖;低密度脂蛋白;單核細(xì)胞

近年來(lái)大量研究表明，冠心病是一種慢性進(jìn)展的炎性疾病，其病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈硬化(cronary arteriosclerosis)及斑塊形成。聚集于動(dòng)脈管壁部位的氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，ox－LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵因素[1]。炎性細(xì)胞及炎性因子可通過(guò)多種組織和病理學(xué)機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，如巨噬細(xì)胞可吞噬ox－LDL形成泡沫細(xì)胞并分泌大量的炎癥細(xì)胞因子從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[2]。β－1，3/1，6－葡聚糖是某些酵母、真菌、谷類和藻類的細(xì)胞壁D葡萄糖的聚合物，是一種生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。很多β－葡聚糖的實(shí)驗(yàn)觀察證明其具有顯著非特異性的免疫應(yīng)答和抗氧化活性等生物學(xué)功能，能夠刺激增強(qiáng)天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的吞噬活性，一氧化氮的產(chǎn)生和炎癥應(yīng)答等[3－4]。我們利用一種酵母來(lái)源的顆粒性β－葡聚糖(whole beta－glucan particle，WGP)，通過(guò)觀察WGP對(duì)ox－LDL誘導(dǎo)的單核－巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥因子[腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，INF－α)、白細(xì)胞介素8 (interleukin 8，IL－8)和白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL－12)]的影響，進(jìn)一步探討β－葡聚糖在拮抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的作用。

材料和方法

一、材料

WGP獲贈(zèng)于美國(guó)路易斯維爾大學(xué)嚴(yán)俊教授，佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)，單核細(xì)胞分離液Ficoll－Paque (上海GE生物公司產(chǎn)品)，TRizol試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Bio－Rad公司的iScript cDNA Synthesis Kits，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒為TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme－linked immunosorbent，ELISA)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Biolegend公司產(chǎn)品)。

二、方法

1.ox－LDL的制備人血漿LDL提取采用一次性密度超速離心法。新鮮人枸櫞酸鉀抗凝血液，室溫低速離心分離血清，用KBr調(diào)密度至1.019～1.063 g/mL，4℃以150 000×g離心5 h，收集LDL，于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中透析48 h，超濾除菌后4℃保存。LDL的氧化修飾采用經(jīng)典硫酸銅方法，將無(wú)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的LDL置于5 μmol Cu2+的PBS中，37℃溫育24 h。修飾后的LDL置于含200 μmol EDTA的PBS中透析24 h后4℃保存。修飾程度用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)法測(cè)定。未經(jīng)氧化的LDL丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量為0.12 nmol/mg蛋白，氧化后ox－LDL的MDA含量為28.7 nmol/mg蛋白。

2.單核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)處理新鮮抗凝血液標(biāo)本2 mL加入2 mL PBS，人單核細(xì)胞分離液4 mL加至PBS稀釋的血液標(biāo)本底部，使液面分層，用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。將單個(gè)核細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在37℃5% CO2的條件下貼壁溫育6 h，收集貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。將分離好的單核細(xì)胞用含1%胎牛血清的RPMI－1640液重懸，置細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板(1×106/孔)37℃培養(yǎng)6 h后，加入PMA至終濃度為100 ng/mL，培養(yǎng)48 h后實(shí)驗(yàn)分為4組(每組均重復(fù)3次)，即無(wú)藥對(duì)照組(繼續(xù)溫育48 h)、ox－LDL組[加ox－LDL(10 μg/mL)溫育48 h]、WGP組[WGP(100 g/mL)溫育2 h，繼續(xù)溫育48 h]、WGP+ox－LDL組[先加WGP(100 g/mL)溫育2 h，之后加ox－LDL(10 μg/mL)繼續(xù)溫育48 h][3，5]。收集上清液離心后凍存于－70℃?zhèn)溆?，收集單核?xì)胞用于提取總RNA。

3.總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增采用TRizol提取液按異硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法提取總RNA，采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度(A260nm)和純度(A260nm/A280nm)。cDNA合成按照iScript cDNA Synthesis Kits操作說(shuō)明進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR引物見表1(所有引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)和合成)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作說(shuō)明書在ABI 7300 real－time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)總體系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL (工作濃度為10 μmol/L)，焦碳酸二乙酯水6 μL，SYBRPremixEXTaqTM10μL，ROX Reference 0.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃30 s;95℃5 s，60℃31 s，共40個(gè)循環(huán)。采用比較閾值法2－△△Ct計(jì)算各細(xì)胞因子cDNA，據(jù)此間接反映mRNA的相對(duì)含量，以同一標(biāo)本待測(cè)指標(biāo)mRNA含量與內(nèi)參照GAPDH mRNA含量的比值表示待測(cè)基因的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增完成后用熔解曲線分析法確定產(chǎn)物特異性。

4.細(xì)胞因子測(cè)定參照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞上清液TNF－α、IL－8和IL－12的水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、WGP對(duì)ox－LDL所致單核－巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

單核－巨噬細(xì)胞經(jīng)10 μg/mL ox－LDL處理48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF－α、IL－8和IL－12濃度明顯增加，與無(wú)藥對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單核－巨噬細(xì)胞經(jīng)100 g/mL的WGP預(yù)處理2 h后加ox－LDL培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)上清液中TNF－α、IL－8和IL－12濃度均顯著降低，與ox－LDL組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1和表2。

表2 各組細(xì)胞上清中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白量的比較(±s，pg/mL)

注:與無(wú)藥對(duì)照組比較，*P＜0.05;與ox－LDL組比較，#P＜0.05

IL－8IL－12無(wú)藥對(duì)照組組別TNF－α 13.00±1.73500.00±96.15115.00±10.39 ox－LDL組38.00±5.57*940.70±91.43*240.70±23.69*WGP+ox－LDL組23.33±4.16#419.00±58.80#106.30±15.82#WGP組15.33±1.53208.30±43.6699.33±14.05

二、WGP對(duì)ox－LDL所致單核－巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

WGP干預(yù)后，再用ox－LDL刺激，與ox－LDL組比較，TNF－α mRNA和IL－8 mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)，而IL－12無(wú)明顯下調(diào)。見圖2。

討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)復(fù)雜的慢性炎癥性過(guò)程，即在一系列心血管危險(xiǎn)因素作用下，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物、細(xì)胞代謝產(chǎn)物和碎片沉積于大、中動(dòng)脈內(nèi)壁，引起血管內(nèi)皮功能紊亂，動(dòng)脈管壁內(nèi)皮下免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，引發(fā)炎性反應(yīng)，最終形成動(dòng)脈粥樣斑塊[6]。

我們?cè)谙惹暗膶?shí)驗(yàn)中對(duì)心絞痛和急性心肌梗死患者檢測(cè)了外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)(數(shù)據(jù)未列出)，結(jié)果顯示急性心肌梗死組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平較健康對(duì)照組明顯升高，而心絞痛組與對(duì)照組無(wú)明顯差異，健康對(duì)照組、心絞痛組、急性心肌梗死組的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)依次升高，且各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示急性心肌梗死組和心絞痛組均顯著低于健康對(duì)照組，這些與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7]。研究結(jié)果提示中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高可能反映冠狀動(dòng)脈的病變程度和急性病變的情況。同時(shí)，循環(huán)中單核細(xì)胞富集浸潤(rùn)可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化，后者吞噬大量氧化修飾的LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積直至形成粥樣硬化斑塊。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)健康志愿者單核－巨噬細(xì)胞與ox－LDL共同培養(yǎng)48 h后，單核－巨噬細(xì)胞上清液中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白含量明顯增加，提示ox－LDL促進(jìn)炎癥因子的分泌和表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化。給予WGP預(yù)處理后，繼用ox－LDL刺激，與ox－LDL組相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF－α、IL－8和IL－12的蛋白含量明顯減少，巨噬細(xì)胞TNF－α mRNA和IL－8 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明WGP具有一定的抑制ox－LDL誘導(dǎo)單核－巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的作用。

β－葡聚糖的活性結(jié)構(gòu)是由葡萄糖單位組成的多聚糖，它能夠活化多種免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞)，全面刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。ROVENSKY等[8]發(fā)現(xiàn)β－葡聚糖對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有抗炎鎮(zhèn)痛作用，且該作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。KARUMUTHIL－MELETHIL等[9]也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用酵母聚糖A(提取自酵母細(xì)胞壁)免疫可以預(yù)防或延緩NOD小鼠1型糖尿病的發(fā)病。另有報(bào)道，Curdlan(由糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)生的葡聚糖)可以誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞生成白細(xì)胞介素10 (interleukin 10，IL－10)，并抑制變應(yīng)性氣道炎癥的發(fā)生，提示葡聚糖可能是通過(guò)抑制或促進(jìn)促炎因子的釋放來(lái)發(fā)揮其抗炎和抗氧化的功能[10]。

β－葡聚糖因其特有的生理功能，受到了廣大科學(xué)工作者的關(guān)注和研究，并已成功應(yīng)用于制藥工業(yè)和保健品業(yè)。其中，幾丁聚糖(β－1，4－聚－葡萄糖胺)已經(jīng)被應(yīng)用到臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)β－1，3/1，6－葡聚糖也能抑制ox－LDL誘導(dǎo)單核－巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，從而拮抗動(dòng)脈粥樣硬化。可以預(yù)見，在冠心病將來(lái)的治療措施中，β－葡聚糖是一種潛在的抑制斑塊以及全身炎性反應(yīng)、穩(wěn)定粥樣斑塊的有效治療藥物。

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The influence of beta-glucan on TNF-α，IL-8 and IL-12 in monocytes

WU Rongqiang1，WANG Sujian1，WANG Shizhong2，ZHOU Haijun2，QI Chunjian2.(1.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China;2.Oncology Institute，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China)

ObjectiveTo study the influence of beta－glucan on tumor necrosis factor alpha(TNF－α)，interleukin 8(IL－8)and interleukin 12(IL－12)in atherosclerosis pathogenesis monocytes.MethodsThe monocytes of healthy subjects were separated by density gradient centrifugation.The monocytes were induced into macrophages by phorbol myristate acetate(PMA)，and the macrophages were induced into foam cells by oxidized low－density lipoprotein (ox－LDL).There were control group，ox－LDL group，whole beta－glucan particle(WGP)group and WGP+ox－LDL group，the total RNA was extracted，and the TNF－α，IL－8 and IL－12 cDNA was amplified.The concentrations in supernates were determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with control group，the protein expression of TNF－α，IL－8 and IL－12 in monocytes were significantly up－regulated by ox－LDL(P＜0.05).After pretreated with WGP，the protein expressions of TNF－α，IL－8 and IL－12 and the mRNA expressions of TNF－α and IL－8wereinhibitedsignificantly(P＜0.05).Conclusionsbeta－glucanmayinhibitedox－LDL－induced pro－inflammatory effects in macrophages，which attenuates the development of atherosclerosis.

Beta－glucan;Low－density lipoprotein;Monocytes

1673－8640(2015)03－0280－04

R446.62

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.019

2014－06－06)

(本文編輯:姜敏)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272323);江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2011244);教育部第46批留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

吳榮強(qiáng)，男，1982年生，學(xué)士，主管技師，主要從事臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)研究。

王蘇建，聯(lián)系電話:0519－88132707。