張馳，張洪波

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430030)

CELL-DYN Sapphire血液分析儀的CD61免疫學(xué)法、光學(xué)法、電阻抗法在低值血小板計(jì)數(shù)中的比較與應(yīng)用

張馳，張洪波

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430030)

目的評(píng)價(jià)和比較CELL－DYN Sapphire血液分析儀的3種檢測(cè)方法在低值血小板(PLT)檢測(cè)方面的優(yōu)劣性。方法選擇基礎(chǔ)血液病或腫瘤化療后引起的PLT低于50×109/L 100例，分別使用電阻抗法、光學(xué)法和CD61免疫學(xué)法3種方法進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)，并與顯微鏡手工法(MPLT)作比較。運(yùn)用SPSS 19.0和MedCalc V12.7.2.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、Passing－Bablok回歸分析和Bland－Altman偏倚分析。結(jié)果ANOVA分析顯示，電阻抗法、光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)與MPLT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.00，P=0.002)，CD61免疫學(xué)法與MPLT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.915);OPLT和CD61免疫學(xué)法與MPLT的相關(guān)性較好(分別為slope 1.0，95%CI為0.95～1.06，r=0.946和slope 1.0，95%CI為0.99～1.01，r=0.998)，電阻抗法與MPLT的相關(guān)性較差(slope 1.27，95%CI為1.10～1.44，r=0.845)。通過(guò)偏差分析，電阻抗法、光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)比MPLT檢測(cè)的數(shù)值更高(差異均值分別為6.3、1.3)，CD61免疫學(xué)法與MPLT檢測(cè)的數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(差異均值=－0.02)。結(jié)論在低值PLT的檢測(cè)中，電阻抗法與MPLT存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)性差，且結(jié)果有明顯偏差(偏高);光學(xué)法與MPLT存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果仍存在少量偏差(偏高)，但相關(guān)性較好;而CD61免疫學(xué)法與MPLT均值無(wú)明顯差異，相關(guān)性好，結(jié)果無(wú)明顯偏差。所以，當(dāng)臨床出現(xiàn)低值病例時(shí)，推薦使用CD61免疫學(xué)法PLT進(jìn)行計(jì)數(shù)。

低值PLT;CD61免疫學(xué)法;光學(xué)法;電阻抗法;CD－SAPPHIRE;預(yù)防性血小板輸注

如何準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)外周血循環(huán)中的血小板(PLT)，一直以來(lái)都是醫(yī)學(xué)界的熱門(mén)話題。但實(shí)際工作中，尤其是在低值PLT計(jì)數(shù)時(shí)，想得到一個(gè)準(zhǔn)確的結(jié)果，卻絕非易事。當(dāng)今市面上的血液分析儀大多數(shù)采用電阻抗法，即庫(kù)爾特原理。因?yàn)槠浔旧硖匦缘南拗?，易受?xì)胞碎片、小紅細(xì)胞、大PLT、PLT聚集簇、細(xì)菌等非PLT顆粒的影響，這種缺陷對(duì)低值PLT樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，影響尤為顯著。而雅培公司的CD－SAPPHIRE血液分析儀在保留電阻抗法的同時(shí)，增加從兩維度分析細(xì)胞的多角度散射光法，使小紅細(xì)胞、紅細(xì)胞碎片與PLT更容易分辨，提高了PLT測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度。但因光學(xué)法每次計(jì)數(shù)PLT的絕對(duì)數(shù)量低于電阻抗法，其重復(fù)性仍劣于電阻抗法。此外，該設(shè)備還具有免疫學(xué)原理和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的技術(shù)檢測(cè)PLT，即利用CD61單克隆抗體特異性結(jié)合PLT表面糖蛋白Ⅲa的特性，先用含有熒光基團(tuán)(如異硫氰酸熒光素)的單克隆抗體(CD41或CD61)標(biāo)記PLT，排除血液中“非PLT顆?！钡母蓴_，再行計(jì)數(shù)，使其準(zhǔn)確性有所提高[2]，對(duì)檢測(cè)低值PLT標(biāo)本和存在干擾的病理性血液標(biāo)本具有重要意義[3]。我們將系統(tǒng)性地探討CDSAPPHIRE血液分析儀CD61免疫學(xué)法與其它兩種分析方法(電阻抗法和光學(xué)法)比較的優(yōu)劣性和臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、一般材料

2012年6月至12月，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院收集全血標(biāo)本光學(xué)法(OPLT)計(jì)數(shù)≤50×109/L的病例100例，其中男50例，女50例，平均年齡45歲(7～87歲)，中位數(shù)為47歲。所有病例都是血液病或腫瘤化療后引起的PLT減低的患者[4]。空腹抽取靜脈血2 mL置于含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA－K2)抗凝劑的真空管中，所有檢測(cè)均在標(biāo)本采集后2 h內(nèi)完成。剔除所有儀器提示有PLT聚集警示，或者有其它干擾警示(如冷凝集或PLT異常分布等)的檢測(cè)樣本的結(jié)果。

二、儀器和試劑

1.儀器美國(guó)雅培公司CELL－DYN SAPPHIRE全自動(dòng)血液分析儀，Leica光學(xué)顯微鏡，改良牛鮑細(xì)胞計(jì)數(shù)板，20 μL微量采血管，美國(guó)BD公司EDTA－K2真空采血管。

2.試劑CELL－DYN SAPPHIRE原裝進(jìn)口配套試劑、原裝CELL－DYN 29 Plus Control(with Retic)質(zhì)控品(level－L、N、H)，原裝CELL－DYN Immuno PLT(CD61)單克隆試劑管，PLT稀釋液使用10 g/L草酸銨溶液，按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第三版)》[5]配制，并于4℃冰箱保存。

三、試驗(yàn)方法

1.儀器經(jīng)培訓(xùn)考核合格的人員操作，測(cè)定時(shí)儀器在校準(zhǔn)期內(nèi)，并按要求進(jìn)行重復(fù)性、精密度、攜帶污染率試驗(yàn)[10]，同時(shí)用配套低、中、高值3種質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)。以確保各自儀器性能的穩(wěn)定。

2.CD61免疫學(xué)法、光學(xué)法和電阻抗法測(cè)定的重復(fù)性分別為1.40%、1.52%和2.44%，攜帶污染率分別為0.113%、0.135%和0.233%，均符合儀器技術(shù)指標(biāo)要求[6]。精密度的測(cè)定，選取3個(gè)PLT(低、中、高值)樣本，分別使用3種方法計(jì)數(shù)，測(cè)定10次，測(cè)得PLT的、s、CV。

3.CD－SAPPHIRE血液分析儀的計(jì)數(shù)法(電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法)EDTA－K2抗凝管采集空腹靜脈血后，按照制造商說(shuō)明書(shū)要求，在CELL－DYN SAPPHIRE分析儀執(zhí)行全血測(cè)定，并使用3種方法來(lái)檢測(cè)PLT，即電阻抗法、光學(xué)法和CD61免疫學(xué)法。電阻抗法和光學(xué)法在儀器的常規(guī)模式下同時(shí)完成檢測(cè)，即“CBC模式”。CD61免疫學(xué)法在儀器的特殊模式下完成檢測(cè)，即“CBC+ CD61模式”。進(jìn)樣模式均采用閉合自動(dòng)進(jìn)樣模式。

4.PLT計(jì)數(shù)參考方法(手工法)該法為世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦[6－8，11]。按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)》[5]操作。手工法由2名主管及以上老師雙盲法完成計(jì)數(shù)，結(jié)果取2次結(jié)果的均值(誤差＜5%)。所有操作均在2 h內(nèi)完成。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以PLT手工計(jì)數(shù)法(MPLT)為對(duì)照組，使用單因素方差分析，來(lái)檢驗(yàn)4組均值差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然后再使用Dunnett檢驗(yàn)分別檢驗(yàn)MPLT與電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法的PLT均值是否存在明顯差異;使用線性回歸分析，分別計(jì)算MPLT與電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)(r)、確定系數(shù)(R2)，來(lái)分別確定它們之間的線性相關(guān)性;使用BLANDALTMAN分析來(lái)評(píng)估均值偏差，分別計(jì)算MPLT法與電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法的均值差、標(biāo)準(zhǔn)差、95%可信區(qū)間的差異;然后以手工法PLT計(jì)數(shù)為參考方法，通過(guò)秩和檢驗(yàn)分析臨床上依據(jù)電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法的PLT結(jié)果進(jìn)行不合理PLT輸注的發(fā)生頻率。以上所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用Microsoft Office Excel 2012、MedCalc V12.7.2.0和SPSS 13.0軟件完成。

結(jié)果

一、電阻抗法、光學(xué)法和CD61免疫學(xué)法PLT精密度測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示均具有較好的精密度，變異系數(shù)(CV)均＜4.0%，符合儀器技術(shù)指標(biāo)要求[6]。見(jiàn)表1。

二、手工法與CD61免疫學(xué)法、光學(xué)法和電阻抗法PLT計(jì)數(shù)的比較

共收集100份樣本。在CD－SAPPHIRE自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，分別得到電阻抗法結(jié)果82例(82%)，光學(xué)法結(jié)果100例(100%)，CD61免疫學(xué)法PLT結(jié)果100例(100%)，其中電阻抗法PLT計(jì)數(shù)有18例(18%)儀器未提供結(jié)果。在儀器檢測(cè)的同時(shí)，MPLT計(jì)數(shù)PLT，獲得結(jié)果100例(100%)。MPLT、電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT的±s分別為(25.14±12.73)×109/L、(35.11±13.68)×109/L、(26.45±13.06)×109/L、(25.12±12.72)×109/L。

運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行Kolmogorov－Smirnov test分析，4組數(shù)據(jù)P均＞0.05，無(wú)明顯線性偏離，顯示呈近正態(tài)分布。MPLT(100例)、電阻抗法(82例)、光學(xué)法(100例)、CD61免疫學(xué)法PLT (100例)P值分別為0.596、0.706、0.755、0.801。

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)4組PLT結(jié)果均值進(jìn)行ANOVA分析:Levene=0.915，P=0.434，所以方差齊;F=10.212，P=0.000，4組均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;再行Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的比較，發(fā)現(xiàn)MPLT與電阻抗法的均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.000)，MPLT與光學(xué)法的均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，MPLT與CD61免疫學(xué)法的均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.915)。

運(yùn)用MedCalc V12.7.2.0軟件，以MPLT為參照，分別與電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT進(jìn)行相關(guān)性分析、Passing－Bablok回歸分析和Bland－Altman偏倚分析。結(jié)果見(jiàn)表2。電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT及MPLT的PLT計(jì)數(shù)之間均無(wú)明顯線性偏離(P均＞0.05)，但光學(xué)法(r =0.946)、CD61免疫學(xué)法PLT(r=0.998)的線性相關(guān)性明顯好于電阻抗法(r=0.845)。見(jiàn)表2。

電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT與MPLT進(jìn)行Passing－Bablok回歸分析，回歸方程分別為Y=－1.066 7+1.266 7X，Y=0.650 0+ 1.000 0X，Y=－0.150 0+1.000 0X。因斜率的95%CI不包含1，說(shuō)明真實(shí)斜率與理論值1之間有明顯不同，則2組數(shù)據(jù)之間存在明顯的比例量系統(tǒng)誤差，所以電阻抗法(斜率為1.27，95%CI為1.10～1.44)與手工法PLT計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而光學(xué)法(斜率為1.0，95%CI為0.95～1.06)和CD61免疫學(xué)法PLT(斜率為1.0，95%CI為0.99～1.01)與MPLT PLT計(jì)數(shù)均無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1～3。

對(duì)電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT與MPLT進(jìn)行Bland－Altman偏倚分析。CD61免疫學(xué)法PLT(Mean difference=－0.02，P=0.70)與MPLT PLT計(jì)數(shù)無(wú)明顯偏倚，而光學(xué)法(Mean difference=1.3，P=0.70)和電阻抗法(Mean difference=6.3，P=0.16)與MPLT PLT計(jì)數(shù)均有輕度偏倚，但電阻抗法的偏倚程度明顯高于光學(xué)法。

為了評(píng)估實(shí)驗(yàn)室提供的不準(zhǔn)確的PLT計(jì)數(shù)值對(duì)臨床的影響，我們先假定世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的MPLT PLT計(jì)數(shù)值最為接近患者真值，把參照MPLT PLT進(jìn)行的PLT預(yù)防性輸注，分別與參照自動(dòng)分析儀提供的電阻抗法、光學(xué)法、CD61免疫學(xué)法PLT進(jìn)行的輸注患者的例數(shù)進(jìn)行比較。然后設(shè)定4個(gè)等級(jí)的PLT輸注閾值: 5×109/L，10×109/L，20×109/L和50×109/L;臨床上依據(jù)自動(dòng)分析儀PLT結(jié)果(3種測(cè)定方法)進(jìn)行PLT預(yù)防性輸注，導(dǎo)致的輸注不足和輸注過(guò)度情況，見(jiàn)表3～5。

H檢驗(yàn)顯示電阻抗法、光學(xué)法與MPLT比較，PLT閾值為50×109/L組的輸注不合理情況和其它各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而CD61免疫學(xué)法與MPLT比較，不同PLT閾值各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

討論

CELL－DYN SAPPHIRE血液分析儀PLT檢測(cè)方法在保留了傳統(tǒng)的庫(kù)爾特原理外，還采用了雙維度多角度散射光檢測(cè)計(jì)數(shù)，并利用免疫學(xué)原理和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的技術(shù)使用CD61免疫學(xué)PLT計(jì)數(shù)法[10]。本試驗(yàn)在保證分析儀3種PLT檢測(cè)法重復(fù)性、攜帶污染率、精密度均合格的基礎(chǔ)上，主要研究該儀器3種方法在低值PLT檢測(cè)方面的優(yōu)劣性。通過(guò)ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，MPLT與CD61免疫學(xué)法PLT計(jì)數(shù)均值無(wú)顯著性差異，但與電阻抗法、光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。通過(guò)PASSING－BABLOK回歸分析發(fā)現(xiàn)，除電阻抗法外，光學(xué)法和CD61免疫學(xué)法與MPLT PLT計(jì)數(shù)的相關(guān)性均較好，且CD61免疫學(xué)法要優(yōu)于光學(xué)法(圖1～3)。通過(guò)偏倚分析發(fā)現(xiàn)，與MPLT相比，電阻抗法比光學(xué)法的偏倚更加顯著，而CD61免疫學(xué)法與MPLT之間無(wú)顯著偏倚(圖1～3)。文獻(xiàn)中得知[11－15]，電阻抗法由于方法學(xué)局限，不能很好地把血液中非PLT顆粒從PLT中精準(zhǔn)的區(qū)別開(kāi)來(lái);光學(xué)法雖提高了PLT甄別的靈敏度，但卻因受到顆粒體積的限制，對(duì)大PLT檢測(cè)無(wú)能為力;而CD61免疫學(xué)法因?yàn)槔肞LT表面特有物質(zhì)——表面糖蛋白Ⅲa，使用單克隆抗體特異性標(biāo)記PLT，可以有效排除血液中“非PLT顆?！钡母蓴_，獲得更為準(zhǔn)確的PLT結(jié)果。本研究所用樣本主要來(lái)源于血液病或者化療后患者，該群體血液中更可能存在紅細(xì)胞碎片、白細(xì)胞凋亡顆粒等非PLT干擾顆粒，從而使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有代表性，更能反映3種方法之間的優(yōu)劣性。

臨床醫(yī)生在進(jìn)行PLT預(yù)防性輸注(prophylactic platelet transfusions，PPT)干預(yù)時(shí)，如PLT計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確有可能會(huì)發(fā)生“PLT輸注不足”與“PLT輸注過(guò)度”的輸注情況?！癙LT輸注不足”是指:臨床醫(yī)生依據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的假性增高的PLT數(shù)值(真值低于輸注閾值)，對(duì)本該進(jìn)行輸注治療的患者未進(jìn)行輸注，造成治療的延誤;“PLT輸注過(guò)度”是指，臨床醫(yī)生依據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的假性減低的PLT數(shù)值(真值高于輸注閾值)，對(duì)本不該進(jìn)行輸注治療的患者進(jìn)行了不必要的輸注，造成經(jīng)濟(jì)上或醫(yī)療資源的浪費(fèi)。在一些研究中，自動(dòng)化血液分析儀由于方法學(xué)局限，可能會(huì)出現(xiàn)一些假性增高的PLT結(jié)果，對(duì)臨床預(yù)防性PLT輸注可能存在潛在影響[16－17]。從表3～5可知，因電阻抗法PLT會(huì)明顯高于實(shí)際值，當(dāng)使用較低PLT輸注閾值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者PLT輸注不足，只有當(dāng)閾值升至50×109/L時(shí)，才能減低PLT輸注不足的情況發(fā)生，但同時(shí)可能導(dǎo)致一些患者過(guò)度輸注和醫(yī)療資源的浪費(fèi)。光學(xué)法的情況稍好，但也不容樂(lè)觀，當(dāng)閾值為5×109/L、10×109/L或20×109/L時(shí)，仍有20%以上輸注不足的情況。如能依據(jù)CD61免疫學(xué)法PLT值進(jìn)行PLT輸注，即使PLT值下降到5 ×109/L，也可基本保證臨床干預(yù)治療的正確性。因?yàn)闇?zhǔn)確檢測(cè)低值PLT的困難性客觀存在，臨床醫(yī)生應(yīng)對(duì)不準(zhǔn)確PLT導(dǎo)致的PLT輸注不足的情況引起重視，也應(yīng)對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室采用何種方法檢測(cè)PLT有充分了解，這樣才能根據(jù)實(shí)際情況，制定合適的預(yù)防性PLT輸注閾值，給患者帶來(lái)積極、正確的干預(yù)治療。雖然PLT的過(guò)度輸注并不會(huì)對(duì)患者帶來(lái)致命傷害，但從減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、減低輸血帶來(lái)的感染風(fēng)險(xiǎn)、減少醫(yī)療資料的浪費(fèi)方面有著積極的醫(yī)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示，臨床實(shí)驗(yàn)室在低值PLT檢測(cè)中，尤其對(duì)于血液病或腫瘤化療后患者，應(yīng)避免使用電阻抗法計(jì)數(shù)，雖光學(xué)計(jì)數(shù)法可接受，但在有條件的情況下，宜采用CD61免疫學(xué)計(jì)數(shù)法，為臨床提供一個(gè)更可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Comparison and application of low platelet counts by CD61 immunological，optical，electrical impedance methods of CELL-DYN Sapphire hematology analyzer

ZHANG Chi1，ZHANG Hongbo2.(Department of Clinical Laboratory，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Hubei Wuhan 430030，China)

ObjectiveTo evaluate and compare the advantages and disadvantages of 3 detection methods of CELL－DYN Sapphire hematology analyzer in the aspect of low platelet(PLT)detection.MethodsA total of 100 patients whose platelet＜50×109/L caused by basis hematonosis or after chemotherapy were enrolled.PLT counts were determined by electrical impedance method(IPLT)，optical method(OPLP)and CD61 immunological method (CD61－PLT).The results were analyzed comparatively with those of manual microscopy.Variance analysis，Passing－Bablok regression analysis and Bland－Altman bias analysis were performed by SPSS 19.0 and MedCalc V12.7.2.0 softwares statistically.ResultsANOVA analysis showed that there was statistical significance for IPLT and OPLT with manual method(MPLT).(P=0.00，P=0.002).CD61－PLT and MPLT had no statistical significance(P=0.915).OPLT and CD61－PLT had good correlation with MPLT without statistical significance[slope 1.0，95%confidence interval(CI):0.95－1.06，r=0.946 and slope 1.0，95%CI:0.99－1.01，r=0.998].IPLT had poor correlation with MPLT with statistical significantce(slope 1.27，95%CI:1.10－1.44，r=0.845).According to variance analysis，the values of IPLT and OPLT were higher than those of MPLT(mean deviations were 6.3 and 1.3).CD61－PLT and MPLT had no significant difference(mean deviation was－0.02).ConclusionsIPLT has significantly statistical difference with MPLT for low PLT determination，with poor correlation，and the result has a significant upward deviation.The means of OPLT and MPLT have statistical significance with good correlation，but the result has a still small upward deviation.The CD61－PLT and MPLT have no obvious difference with a good correlation，and the results are not significantly different.Therefore，it is recommended that we can use CD61－PLT as a new reference method and OPLT and IPLT as alternative methods.

Low platelet;CD61 immunological method;Optical method;Electrical impedance method; CD－SAPPHIRE;Prophylactic platelet transfusion

1673－8640(2015)03－0274－06

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.018

2014－07－03)

(本文編輯:范基農(nóng))

張馳，男，1980年生，碩士，主管技師，主要從事感染免疫學(xué)相關(guān)研究。