黃紅宇， 李光乾

(杭州市兒童醫(yī)院神經(jīng)科，浙江 杭州 310014)

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依達(dá)拉奉對(duì)驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬中caspase-3和caspase-12表達(dá)的影響

黃紅宇， 李光乾△

(杭州市兒童醫(yī)院神經(jīng)科，浙江 杭州 310014)

目的： 探討依達(dá)拉奉(edaravone，ED)對(duì)幼年大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)后海馬中caspase-3和caspase-12表達(dá)的影響。方法: 將195只SD幼年雄性大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、SC組和ED組；各組又均按時(shí)點(diǎn)分為4 h、12 h、24 h、48 h和72 h 5個(gè)亞組，每組13只。采用氯化鋰-匹魯卡品化學(xué)點(diǎn)燃法制備幼年大鼠SC模型。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬中caspase-3和caspase-12蛋白表達(dá)情況，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)caspase-3和caspase-12 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: (1)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SC 24～72 h組幼年大鼠海馬中caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，與NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SC組比較，ED 48～72 h組的caspase-3 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-3 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白基本相似。(2)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SC組幼年大鼠海馬中12～72 h組caspase-12表達(dá)增強(qiáng)，與NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與SC組比較，ED 24～72組caspase-12表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-12 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白基本相似。(3)經(jīng)比較，ED組Ⅴ級(jí)驚厥率較SC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: 依達(dá)拉奉可抑制匹魯卡品所致SC大鼠海馬caspase-12和caspase-3的表達(dá)，提示依達(dá)拉奉對(duì)SC引起的腦損傷可能有保護(hù)作用。

Caspase-3； Caspase-12； 驚厥持續(xù)狀態(tài)； 依達(dá)拉奉

驚厥(convulsion)是常見的小兒神經(jīng)系統(tǒng)急癥，系中樞神經(jīng)系統(tǒng)或各種全身性疾病使腦細(xì)胞功能紊亂，部分神經(jīng)元突然異常和過度超同步化放電所致。發(fā)病率為3%～5%，其中20%為反復(fù)驚厥或驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)。反復(fù)的驚厥或SC易引起神經(jīng)元不可逆損傷，導(dǎo)致海馬等部位的神經(jīng)元壞死和凋亡[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)啟動(dòng)的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，已有研究證明反復(fù)驚厥或SC也可誘導(dǎo)ERS，且與神經(jīng)元凋亡有密切關(guān)系[1]。Caspase-12是ERS介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶[2]，但其與線粒體損傷途徑密切相關(guān)的caspase-3是否確實(shí)存在交連，尚未有定論。依達(dá)拉奉(edaravone，ED)是一種新型的自由基清除劑和抗氧化劑，在缺血缺氧性腦病的研究中證實(shí)其具有神經(jīng)保護(hù)等作用[3]；我們的前期研究表明ED對(duì)驚厥性腦損傷也有保護(hù)作用[1, 4]，但其保護(hù)機(jī)制有待于深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過制作大鼠SC模型，觀察SC大鼠海馬半胱氨酸門冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)-3和caspase-12蛋白及其mRNA的動(dòng)態(tài)變化，并應(yīng)用ED進(jìn)行干預(yù)。旨在探討ED對(duì)SC后幼年大鼠海馬caspase-3與caspase-12表達(dá)的影響，以了解ED對(duì)SC大鼠海馬細(xì)胞凋亡通路的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)19 d齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠195只，體重50～70 g。購于中國科學(xué)院上海分院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXX(滬)2003-0003，置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2 d，自由攝食、水，室溫25 ℃，相對(duì)濕度70%，12/12 h晝夜照明變化。

氯化鋰、匹魯卡品和溴化甲基東莨菪堿均購于Sigma；Trizol Reagent試劑購于Invitrogen；RT-PCR試劑盒購于Fermantas；caspase-3和caspase-12抗體購于US Biological，羊抗兔IgG及SABC試劑盒均購于上海晶美公司；目的基因及內(nèi)參照均利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，然后經(jīng)過BLAST匹配，由上海生工生物工程有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及模型的制作 隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(SC組)和依達(dá)拉奉組(ED組)3大組；每組再按時(shí)點(diǎn)隨機(jī)分4 h、12 h、24 h、48 h和72 h和5個(gè)亞組，每亞組13只。模型制作參照李光乾等[1]的方法并稍做改進(jìn)，具體方法如下：SC組按127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰，18 h后按1 mg/kg劑量腹腔注射硫酸阿托品以拮抗匹魯卡品外周膽堿能反應(yīng)，30 min后按100 mg/kg劑量腹腔注射匹魯卡品。觀察SC組大鼠出現(xiàn)驚厥發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)。大鼠驚厥按Racine分級(jí)，0級(jí)：無任何發(fā)作跡象；Ⅰ級(jí)：凝視、咀嚼和須動(dòng)；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭、濕狗樣抖動(dòng)或搔抓；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣抽搐；Ⅳ級(jí)：伴后肢站立的全身強(qiáng)直性發(fā)作；Ⅴ級(jí)：伴有站立并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。驚厥發(fā)作達(dá)Ⅳ～Ⅴ級(jí)，持續(xù)時(shí)間達(dá)30 min以上，驚厥緩解后狀態(tài)良好的大鼠為合格SC大鼠模型。當(dāng)驚厥發(fā)作達(dá)30 min時(shí)，給予10%水合氯醛400 mg/kg、阿托品1 mg/kg腹腔注射，如不能緩解驚厥，可重復(fù)給予水合氯醛1～2次，直至驚止。ED組于驚厥前3 d予以ED腹腔注射(5 mg/kg)，每天1次，連續(xù)3 d，其它處理同SC組。NS組用生理鹽水代替氯化鋰及匹魯卡品，其它處理同SC組。

2.2 動(dòng)物腦標(biāo)本的采取及制作 采取水合氯醛(400 mg/kg)麻醉動(dòng)物，斷頭處死。迅速剝離顱骨，完整取出腦組織，置于冰盤上，采用高溫(180 ℃)滅RNA酶的刀片和鑷子沿矢狀裂將腦組織切分；右側(cè)腦組織快速分離出海馬，放入去RNA 酶的EP 管中，迅速置于-80 ℃液氮中保存。將其左半球在距額極2 mm和距尾極1 mm處各切1刀，取中間段置4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h，脫水、石蠟包埋后，用振蕩切片機(jī)從視交叉處開始作冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm。

2.3 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)caspase-3和caspase-12 mRNA含量 取液氮保存的海馬標(biāo)本，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)用GAPDH作為內(nèi)參照，caspase-3、caspase-12和內(nèi)參照的引物序列見表1。PCR體系為：cDNA 3 μL，10×buffer 2.0 μL，MgCl21.2 μL，dNTP 0.5 μL，ddH2O 11.5 μL，Taq酶 0.2 μL，上、下游引物各0.8 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。各目的基因的PCR反應(yīng)條件如下，caspase-3：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；caspase-12：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；GAPDH：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個(gè)循環(huán)。各取4 μL PCR產(chǎn)物在1.67%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)下掃描，用Smart View軟件測(cè)定產(chǎn)物吸光度(absorbance,A)，用目的條帶產(chǎn)物A值與GAPDH產(chǎn)物A值之比表示組織中目的基因的mRNA相對(duì)含量。

表1 PCR各引物序列

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)海馬CA1區(qū)caspase-3和caspase-12的蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)海馬CA1區(qū)的caspase-3蛋白：60 ℃烤片60 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟15 min，乙醇梯度水化各5 min，檸檬酸高壓修復(fù)20 min，3% H2O2室溫10 min，正常兔血清室溫封閉10 min，caspase-3抗體(1∶25)4 ℃冰箱內(nèi)過夜，生物素化IgG 37 ℃ 10 min，SABC 37 ℃ 10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片；陰性對(duì)照組用PBS代替caspase-3抗體。海馬CA1區(qū)caspase-12蛋白的檸檬酸高壓修復(fù)時(shí)間為10 min，其余步驟同caspase-3；陰性對(duì)照組用PBS代替caspase-12抗體。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡下視野(×400)，應(yīng)用Image-Pro Plus 圖像分析軟件測(cè)定陽性部位的積分吸光度(integral absorbance,IA)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著性差異(least-significant difference，LSD)法，兩變量的相關(guān)采用Pearson等級(jí)相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氯化鋰-匹魯卡品致幼年大鼠驚厥發(fā)作及驚厥潛伏期情況

從表2可以看出，SC組在腹腔注射匹魯卡品后(16.67±5.40) min成功誘導(dǎo)出Ⅳ級(jí)及以上SC的幼年大鼠各61只，其中Ⅴ級(jí)驚厥56只，Ⅴ級(jí)驚厥率為91.80%(56/61)；而ED組在腹腔注射PILO后(21.21±6.39) min有60只幼鼠誘發(fā)出Ⅳ級(jí)及以上的發(fā)作，其中Ⅴ級(jí)45只，Ⅴ級(jí)驚厥率為75.00%(45/60)。ED組Ⅴ級(jí)驚厥率較SC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 ED組與SC組大鼠Ⅴ級(jí)驚厥率和平均驚厥潛伏期的比較

2 各組幼年大鼠海馬caspase-3的mRNA水平

NS組在驚厥后各時(shí)點(diǎn)海馬caspase-3 的mRNA表達(dá)無明顯變化。SC組除4 h外各亞組海馬caspase-3 的mRNA表達(dá)均較NS組顯著增高(P<0.05)，mRNA表達(dá)在SC后12 h開始升高，48 h達(dá)峰值，72 h顯著下降。ED組大鼠海馬caspase-3 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與SC組相似，但在24 h、48 h和72 h較SC組顯著降低(P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1.The mRNA expression of caspase-3 in the hippocampus of young rats at different time points shown by electrophoresis.

表3 各組幼年大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬caspase-3 mRNA灰度比值比較

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05，##P<0.01vsSC group.

3 各組幼年大鼠海馬區(qū)caspase-12 mRNA水平

結(jié)果顯示，SC組大鼠海馬在12 h～48 h各時(shí)點(diǎn)caspase-12 mRNA的表達(dá)均顯著高于NS組(P<0.05)，其表達(dá)在SC后12 h 開始顯著升高，24 h達(dá)峰值，48 h開始下降，于72 h迅速降至基線水平。ED組大鼠海馬caspase-12的 mRNA時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)與SC組相似，在24 h達(dá)峰，但其在24 h和48 h caspase-12 mRNA的表達(dá)均顯著低于SC組(P<0.05)；但24 h caspase-12 mRNA的表達(dá)仍明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表4。

Figure 2.The mRNA expression of caspase-12 in the hippocampus of young rats at different time points shown by electrophoresis.

表4 各組幼年大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬caspase-12 mRNA灰度值比較

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsSC group.

4 各組幼年大鼠海馬CA1區(qū)的caspase-3蛋白檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-3定位于胞漿和胞膜，主要表達(dá)在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。NS組各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)可見極少量弱陽性細(xì)胞出現(xiàn)。SC組大鼠海馬在各時(shí)點(diǎn)有不同程度的棕黃色染色細(xì)胞表達(dá)，在驚厥后48 h有多量神經(jīng)元出現(xiàn)強(qiáng)陽性染色。

SC組大鼠在驚厥后12 h caspase-3蛋白表達(dá)開始增高，于48 h達(dá)峰值，在SC后24 h、48 h和72 h表達(dá)水平與NS組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而ED組大鼠海馬caspase-3 蛋白表達(dá)趨勢(shì)雖與SC組相似，亦在48 h達(dá)峰，但其峰值較SC組顯著降低(P<0.05)；但在48 h時(shí)點(diǎn)其CA1區(qū)蛋白A值仍均高于NS組(P<0.01)，見圖3、表5。

Figure 3.The protein expression of caspase-3 in hippocampal CA1 area at 48 h in young rats.

表5 各組幼年大鼠在SC后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白A值的比較

*P<0.05,**P<0.01vsNS group; #P<0.05vsSC group.

5 各組幼年大鼠海馬CA1區(qū)的caspase-12蛋白檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-12蛋白主要表達(dá)在海馬神經(jīng)元上，未活化的caspase-12蛋白主要定位于胞漿和胞膜，SC后12 h核表達(dá)增加，24 h大量神經(jīng)元胞核強(qiáng)陽性黃染，48 h核黃染減輕，提示活化的caspase-12蛋白增加。

NS組caspase-12蛋白各時(shí)點(diǎn)有少量弱陽性表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)。SC組大鼠在驚厥后12～72 h海馬CA1區(qū)caspase-12蛋白表達(dá)均顯著高于NS組(P<0.01)，于驚厥后12 h顯著增加，24 h達(dá)高峰，48 h開始緩慢下降。ED組高峰平緩，各時(shí)點(diǎn)caspase-12蛋白水平均低于SC組，24～72 h時(shí)點(diǎn)caspase-12蛋白水平明顯低于SC組(P<0.05)；但在12 h～48 h時(shí)點(diǎn)caspase-12蛋白表達(dá)仍顯著高于NS組(P<0.05)，見圖4、表6。

Figure 4.The protein expression of caspase-12 in hippocampal CA1 area at 24 h in young rats.

表6 各組幼年大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)caspase-12蛋白A值的比較

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsSC group.

討 論

既往SC后腦損傷機(jī)制研究的重點(diǎn)一直集中在死亡受體活化和線粒體損傷這2條經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑上，近年發(fā)現(xiàn)ERS反應(yīng)性凋亡途徑[1]是一條新的凋亡途徑。適當(dāng)?shù)腅RS有利于減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，使其恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞抵抗應(yīng)激的能力；當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法得到恢復(fù)時(shí)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。Caspases-12 主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是ERS介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，可能處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白IRE1、ATF6和PERK通路的共同下游[5]。有關(guān)腦缺血的研究已證實(shí)，由caspase-12 介導(dǎo)的ERS反應(yīng)性細(xì)胞凋亡途徑在缺血性腦損傷方面有重要作用。反復(fù)驚厥或SC導(dǎo)致的大腦病理生理狀態(tài)具有誘導(dǎo)ERS的條件。但過度的ERS會(huì)導(dǎo)致caspase-12的激活和釋放[6]。本研究結(jié)果顯示，SC組幼年大鼠海馬caspase-12 mRNA的水平在驚厥后12 h即迅速升高，24 h達(dá)峰，在48 h開始緩慢下降；通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，SC組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元在24 h后核棕黃色染色明顯增加，提示caspase-12 活化后可以轉(zhuǎn)位到核內(nèi)起作用。但caspase-12 蛋白于驚厥后48 h達(dá)高峰，72 h才顯著下降，與caspase-12 mRNA的表達(dá)不同步，我們認(rèn)為這種高峰不同步可能與早期蛋白翻譯抑制或不平衡有關(guān)。

Caspase-3 可能是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)之一，在幾乎所有的凋亡中被最后活化的caspase 分子，被認(rèn)為是凋亡的最終效應(yīng)蛋白[7]。生理情況下，caspase-3 以無活性的酶原(pro-caspase-3)形式存在于哺乳動(dòng)物多種組織和細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞凋亡過程中，多種刺激因素的啟動(dòng)信號(hào)均可激活caspase-3，活化的caspase-3又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白級(jí)聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡，故常將caspase-3 的活化程度作為判斷細(xì)胞凋亡嚴(yán)重性的可靠指標(biāo)之一[8]。近年來，有研究者在紅藻酸所致大鼠癲癇模型中，發(fā)現(xiàn)caspase-3在驚厥發(fā)作致神經(jīng)元損傷過程中具有關(guān)鍵作用[8]；而應(yīng)用caspase-3特異性抑制劑后，海馬組織神經(jīng)元凋亡明顯減少[9]，從而證實(shí)caspase-3在驚厥發(fā)作引起的神經(jīng)元死亡機(jī)制中確實(shí)發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，驚厥后12 h 幼年大鼠海馬caspase-3的 mRNA和蛋白表達(dá)開始升高，24～48 h達(dá)高峰，72 h緩慢下降，提示匹魯卡品誘導(dǎo)的SC大鼠海馬caspase-3表達(dá)的變化可能在驚厥后海馬損傷過程中起重要作用。

從結(jié)構(gòu)和功能上分，caspase-12 與caspase-3 共同被認(rèn)為在是凋亡酶家族中的凋亡效應(yīng)酶，但兩者之間的關(guān)系卻仍不十分統(tǒng)一。許多研究表明，caspase-12 在ERS反應(yīng)凋亡途徑中位于凋亡級(jí)聯(lián)的始動(dòng)點(diǎn)，活化的caspase-12 作為ERS反應(yīng)性凋亡的始動(dòng)因子激活caspase-9，使其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步激活caspase-3，最終由caspase-3執(zhí)行凋亡[5, 10-11]，提示ERS相關(guān)性凋亡與線粒體損傷途徑可能存在一定的交聯(lián)。但Biagioli等[12]在用cadmium誘導(dǎo)細(xì)胞ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，caspase-12和caspase-3 激活的時(shí)間相近，推測(cè)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑在激活時(shí)間上是平行的。Takai等[13]最近在雌性生殖細(xì)胞凋亡機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，caspase-12具有相對(duì)獨(dú)立性，缺乏caspase-3和caspase-12的狀態(tài)下，其激活也能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果雖然顯示caspase-12與caspase-3存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但它們隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本同步，故并不排除caspase-12誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)性凋亡途徑具有相對(duì)獨(dú)立性的可能。

ED是一種新型的自由基清除劑和抗氧化劑，分子量小，具有親脂基團(tuán)，其血腦屏障穿透率約高達(dá)60%，可在腦內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度；且其在體內(nèi)以陰離子形式存在，脂溶性高，容易穿過血腦屏障，故起效迅速。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，ED通過捕獲羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用、抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化作用，減輕腦水腫。故該藥尤其對(duì)缺血性腦損傷具有很強(qiáng)的腦保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ED組Ⅴ級(jí)驚厥率較SC組低，且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長(zhǎng)，提示ED對(duì)幼年大鼠驚厥性腦損傷可能具有早期保護(hù)作用。ED預(yù)處理組可在SC后72 h內(nèi)各時(shí)點(diǎn)明顯降低大鼠海馬caspase-12 mRNA和蛋白的水平，且此作用在24 h～48 h最強(qiáng)，并延續(xù)到本實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)72 h。但本研究也發(fā)現(xiàn)其并不能完全逆轉(zhuǎn)或者抑制caspase-12在SC后的升高。以上均提示依達(dá)拉奉可以調(diào)節(jié)SC誘導(dǎo)的ERS功能，部分抑制后期由caspase-12介導(dǎo)的ERS反應(yīng)性凋亡信號(hào)通路的激活。該通路也可能是依達(dá)拉奉除高效清除氧自由基等機(jī)制以外的新作用位點(diǎn)。

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Effects of edaravone on expression of caspase-3 and caspase-12 in juvenile rat hippocampus after status convulsion

HUANG Hong-yu, LI Guang-qian

(DepartmentofPediatricNeurology,HangzhouChildren’sHospital,Hangzhou310014,China.E-mail:lgqwz@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of edaravone (ED) on the expression of caspase-3 and caspase-12 in the juvenile rat hippocampus after status convulsion (SC).METHODS: Juvenile male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal saline (NS) control group, SC group and ED treatment group. The rats in each group were further divided into 5 subgroups according to different time points. The rats in SC group were kindled into epilepsy by lithium-pilocarpine chemical method. The protein expression of caspase-3 and caspase-12 was determined by immunohistochemistry methods. The mRNA expression of caspase-3 and caspase-12 was detected by RT-PCR. RESULTS: (1) TheIAvalue of caspase-3 positive cells in 24～72 h SC group increased compared with NS group. With ED intervention, theIAvalue of caspase-3 positive cells decreased as compared with 48～72 h SC group. The results of RT-PCR showed that the mRNA expression of caspase-3 was similar to the changes of protein. (2) The results of immunohistochemistry showed that the IA value of caspase-12 positive cells in 12～72 h SC group increased compared with NS group. With ED intervention, theIAvalue of caspase-12 positive cells decreased as compared with 24～72 h SC group. The results of RT-PCR showed that the mRNA expression of caspase-12 was similar to the changes of protein. (3) In ED group, Ⅴ grade convulsion was lower than that in SC group, and the latent period of seizures in ED group was significantly longer than that in SC group. CONCLUSION: Edaravone inhibits the expression of caspase-3 and caspase-12 in pilocarpine-induced seizures in rat hippocampus, suggesting that edaravone has protective effect against the damage caused by status convulsion.

Caspase-3; caspase-12; Status convulsion; Edaravone

1000- 4718(2015)03- 0562- 07

2014- 08- 25

2014- 11- 20

△通訊作者 Tel： 0571-85465414； E-mail： lgqwz@aliyun.com

R363； R729

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.032