李曉琳， 王滌非， 邵 晨， 費 寧， 李國嬌， 曲必成

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110001)

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波動性葡萄糖對胰島細胞凋亡及PTEN表達的影響*

李曉琳#， 王滌非△， 邵 晨， 費 寧， 李國嬌， 曲必成

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110001)

目的： 研究細胞凋亡是否與PTEN表達升高相關(guān)，并探討PTEN表達升高是否通過活性氧簇(ROS)進行調(diào)控。方法：細胞分為5組：恒定低糖組(L組)、恒定高糖組(H組)、葡萄糖波動組(F組)、高糖后低糖組(HL組)及波動后低糖組(FL組)。檢測各組ROS水平、細胞凋亡率、細胞內(nèi)鈣離子濃度、胰島素水平和PTEN蛋白的表達。結(jié)果：F組較H、L組鈣離子濃度升高，胰島素分泌減少，ROS水平升高，PTEN蛋白表達增加，細胞凋亡增多(P<0.05)。HL組較H組鈣離子濃度、ROS水平、PTEN蛋白表達和凋亡率有所下降，但仍高于L組(P<0.05)。FL組較F組鈣離子濃度、ROS水平、PTEN蛋白表達和凋亡率有所下降，但仍高于低糖組(P<0.05)。結(jié)論：波動性葡萄糖較恒定高糖更易導致胰島細胞凋亡，可能與細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，加重氧化應(yīng)激促進PTEN表達增加有關(guān)。葡萄糖濃度恢復可一定程度解除氧化應(yīng)激，使PTEN表達減少,細胞損傷減輕。

葡萄糖波動； 胰島細胞； 氧化應(yīng)激； 細胞凋亡； PTEN

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，胰島素抵抗或缺乏是其主要特征。高血糖可以造成胰島β數(shù)量減少功能減低，以波動性高血糖尤為嚴重[1]。目前認為可能與血糖波動導致氧化應(yīng)激密切相關(guān)。第10號染色體同源缺失性磷酸酶及張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)基因是目前唯一具有雙特異磷酸脂酶活性的抑癌基因，是機體細胞生長、分化和維持生命活動的重要生物抑制分子[2-3]。本文將研究胰島β細胞凋亡是否與PTEN表達升高相關(guān)，并探討PTEN表達升高是否通過活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)進行調(diào)控。

材 料 和 方 法

1 細胞和材料

胰島β細胞為大鼠離體胰島組織提取細胞株，由中國醫(yī)科大學生物化學實驗室劉瑩教授饋贈。

無糖1640培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基購自Gibco；活性氧檢測試劑盒、Hoechst 33342染色劑和DiI染色劑購自碧云天公司；兔抗鼠PTEN多克隆抗體購自SAB；C肽全自動化學發(fā)光測定試劑盒購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 分離的大鼠胰島β細胞株于含10%胎牛血清、葡萄糖濃度為2 g/L的1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。

2.2 實驗分組 本實驗分為5組：(1)恒定低糖(low glucose,L)組：在葡萄糖濃度為5.5 mmol/L 的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；(2)恒定高糖(high glucose,H)組：在葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；(3)葡萄糖波動(glucose fluctuation,F)組：在葡萄糖濃度為33.3 mmol/L與5.5 mmol/L的1640培養(yǎng)基每12 h交替培養(yǎng)72 h；(4) 高糖后低糖(HL)組：在葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后在葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h；(5) 波動后低糖(FL)組：按F組方法波動培養(yǎng)36 h后用5.5 mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h。

2.3 指標檢測 (1)PI和Annexin V雙標記法檢測細胞凋亡：取1×109/L的懸浮細胞500 μL，離心、棄上清、吹打懸浮，反復3～4次后，加入200 μL binding buffer、10 μL Annexin V室溫避光反應(yīng)15 min，再加入300 μL binding buffer和5 μL PI，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測；并且為觀察細胞生長變化置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。(2)化學發(fā)光法檢測胰島素水平：離心收集培養(yǎng)細胞后12 h上層培養(yǎng)基，各組取30 μL上機檢測胰島素水平。(3)活性氧檢測試劑盒檢測各組細胞ROS水平：無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA至濃度為10 μmol/L，6孔板培養(yǎng)細胞，每孔加DCFH-DA≥1 mL，37 ℃孵育20 min，無血清培養(yǎng)基洗滌3遍，收集細胞于流式細胞儀檢測。(4)Fluo3-AM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度及熒光顯微鏡下觀察：每組細胞HBSS緩沖液洗滌3次后加入Fluo3-AM工作液，37 ℃孵育30 min；HBSS溶液洗滌3次,HBSS溶液覆蓋細胞，37 ℃孵育20分鐘。懸浮細胞，分光光度計進行檢測，通過公式[Ca2+]i(nmol/L)=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)，Kd=450 nmol/L，計算出細胞內(nèi)鈣離子濃度；并于熒光顯微鏡下觀察熒光表達。(5)免疫印跡法(Western blotting)檢測各組細胞中PTEN蛋白表達：Folin-酚試劑方法進行蛋白定量；制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，抗兔多克隆PTEN抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。洗膜，1∶10 000辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(Ⅱ抗)常溫孵育2 h，洗膜，ECL顯影曝光。GraphPad Prism 5軟件進行灰度值分析。(6)PTEN免疫熒光染色：固定細胞，封閉液封閉， PTEN I抗(1∶100)4 ℃孵育過夜。洗滌，Ⅱ抗(抗兔FITC，1∶500稀釋)避光反應(yīng)2 min，洗滌，DiI避光反應(yīng)5 min，洗滌，Hoechst 33342 4 ℃避光反應(yīng)20分鐘，洗滌，抗淬滅后倒置熒光顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學處理

每組數(shù)據(jù)留取20組樣本，取平均值，并采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 細胞凋亡

PI和Annexin V雙標記法檢測細胞凋亡，結(jié)果如表1所示。L、H、F組細胞凋亡率呈階梯增高，兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，HL組較H組、FL組較F組凋亡率下降(P<0.05)。

表1 胰島β細胞經(jīng)不同處理其細胞凋亡率、胰島素分泌水平、ROS生成、細胞內(nèi)鈣離子濃度和鈣觀察熒光強度的變化

*P<0.05vsL;#P<0.05vsH;△P<0.05vsF.

40倍相差顯微鏡下觀察，L組細胞團呈圓形或橢圓型, 大小不一，有完整而清晰的被膜；H組形狀不規(guī)則，被膜不完整，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞核固縮，細胞數(shù)量減少；F組細胞形成凋亡小體，壞死細胞呈簇狀漂?。籋L組及FL組細胞凋亡分別較H、F組有所減輕，細胞數(shù)目增多，見圖1。

Figure 1.The morphological changes of the islet cells with different treatments observed under inverted microscope (×40).

2 胰島素水平檢測

如表1所示，相同數(shù)目的細胞在不同環(huán)境培養(yǎng)后，其分泌蛋白胰島素水平受到不同程度影響。

3 氧化應(yīng)激

L、H、F組細胞ROS水平呈階梯增高(P<0.05)，HL組較H組、FL組較F組ROS水平降低(P<0.05)。

4 細胞內(nèi)鈣離子濃度測定及熒光顯微鏡觀察并定量分析

L、H、F各組細胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，葡萄糖濃度恢復后鈣離子濃度降低，見表1。

Fluo3-AM染色后在20倍熒光顯微鏡下觀察熒光強度并用流式細胞技術(shù)定量分析，結(jié)果顯示低糖組與恒定高糖組及葡萄糖波動組比較細胞染色數(shù)量及熒光強度依次遞增；高糖后低糖組較恒定高糖組熒光數(shù)量減少，熒光強度減低；波動后低糖組較葡萄糖波動組熒光數(shù)量減少，熒光強度減低，見圖2、表1。

5 細胞中PTEN蛋白的表達及免疫熒光觀察

F組及H組較L組PTEN蛋白表達水平增加(P<0.05)，F(xiàn)組較H組增加(P<0.05)，HL、FL組PTEN蛋白表達分別較H、F組下降(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The morphological changes of the islet cells with different treatments observed under fluorescence microscope with Fluo3-AM staining (×20).

Figure 3.The protein expression of PTEN in the islet cells with different treatments detected by Western blotting.

在熒光纖維鏡下觀察胰島β細胞PTEN表達，可見Hoechst 33342可以將細胞核染成藍色，DiI將細胞膜染成橙紅色，含有FITC標記的山羊抗兔IgG抗體可以將細胞標記成綠色。40倍倒置熒光顯微鏡觀察L、H、F組細胞核及胞漿處PTEN表達逐漸增多，高糖后低糖各組PTEN表達減少，熒光強度減弱。此結(jié)果與Western blotting方法檢測各組細胞中PTEN蛋白產(chǎn)物表達含量相一致，見圖4。

討 論

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，以血漿葡萄糖水平增高為特征。任何一種糖尿病都離不開胰島細胞凋亡所致的胰島素缺乏[4-5]。臨床上慢性高血糖有2種表現(xiàn)形式,即慢性持續(xù)性高血糖(sustained high glucose，SHG)和波動性高血糖(intermittent high glucose，IHG)。有研究表明血糖波動對糖尿病患者的影響可能大于單純性高血糖[6-7]。Hou等[8]研究發(fā)現(xiàn)波動性高血糖可進一步放大高血糖對β細胞造成的氧化應(yīng)激損傷，加重β細胞凋亡及功能障礙[9]。本實驗針對高血糖引起胰島細胞凋亡進行研究，以進一步論證細胞在恒定、波動高糖以及高糖后低糖條件下通過氧化應(yīng)激誘導細胞凋亡的情況。

Figure 4. The protein expression of PTEN in the islet cells with different treatments observed under fluorescence microscope (×40).

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑平衡被打破，產(chǎn)生潛在傷害。機體抗氧化劑減少或者抗氧化能力下降時，可產(chǎn)生ROS。過量的ROS會使脂質(zhì)發(fā)生過氧化、引起蛋白質(zhì)變性交聯(lián)、DNA斷裂等，直接導致細胞損傷[10]。線粒體是ROS形成的主要場所，也是最早和最容易受到 ROS攻擊的細胞器[11]，線粒體功能紊亂時，細胞膜脂質(zhì)過氧化，引起線粒體膨脹及外膜破裂，炎癥介質(zhì)外漏，激活細胞凋亡通路，產(chǎn)生更多的ROS，形成惡性循環(huán)[12]?？傊?，氧化應(yīng)激是造成胰島β細胞“葡萄糖毒性”的重要機制之一[13]。

葡萄糖代謝使胞內(nèi)ATP/ADP 的比值增加，關(guān)閉鉀離子通道，鈣離子通道開放，胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，導致含胰島素囊泡的釋放。由此可見,細胞內(nèi)Ca2+作為第二信使,在胰島素分泌過程中起著重要的作用。作為氧化應(yīng)激主要場所的線粒體也同樣受到胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。當葡萄糖濃度升高時，Ca2+流入細胞內(nèi)的同時氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS，可破壞線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學梯度，阻止線粒體對Ca2+的進一步攝取，胰島素分泌下降。當葡萄糖濃度持續(xù)升高，胰島β細胞凋亡，功能障礙，數(shù)量減少，胰島素分泌進一步減少。當葡萄糖濃度恢復至正常一段時間后，線粒體內(nèi)外膜兩側(cè)及氧化應(yīng)激恢復平衡，實驗結(jié)果提示ROS水平降低，細胞內(nèi)Ca2+濃度下降，胰島素分泌增多，細胞凋亡減少，細胞狀態(tài)是可逆的，但仍無法恢復至低糖培養(yǎng)的細胞狀態(tài)。

PTEN基因是1997年由美國3個獨立研究小組在人類第10號染色體上發(fā)現(xiàn)的一個新的抑癌基因[14]。PTEN蛋白的結(jié)構(gòu)包括3個部分，其中尾區(qū)是PTEN的磷酸化區(qū)域，PTEN磷酸化后其活性減低,穩(wěn)定性增強，處于失活狀態(tài)，相反則可增強PTEN活性。對于PTEN的細胞定位,長期以來存在爭論，而近些年來，不同細胞的研究結(jié)果表明，PTEN主要分布于細胞質(zhì)中，細胞核內(nèi)也有表達，而只有很少的蛋白存在于細胞質(zhì)膜上[15]。

PTEN蛋白主要通過PI3K/Akt、局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3條信號通路發(fā)揮作用，調(diào)控細胞遷移、增殖及生長[16]。目前研究比較多的是第1條通路。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)在細胞生長因子的作用下在細胞膜產(chǎn)生3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)和4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)，PIP2可在PI3K的作用下磷酸化為PIP3，PIP3使Akt與細胞膜結(jié)合錨定并釋放下來，活化的Akt與其它相關(guān)蛋白能啟動一系列蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)，通過磷酸化下游不同的底物調(diào)控著細胞周期、細胞生長及細胞代謝等。研究發(fā)現(xiàn),PTEN蛋白主要是針對底物PIP3的調(diào)節(jié)，對PI3K通過脂質(zhì)磷酸酶活性發(fā)揮負調(diào)控的功能。而PTEN使PIP3脫磷酸，使PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，使PIP3含量減少，抑制Akt及其下游激酶的活性，抑制細胞生長和促進凋亡，因此PTEN是一個很有效的PI3K信號通路的負性調(diào)節(jié)因子[17-18]。

也有報道稱氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2可以氧化抑制PTEN的活性，使細胞內(nèi)PI3K活性增強和PIP3濃度升高；而在敲除PTEN基因后，H2O2刺激則對PI3K活性和PIP3濃度無影響[19]。目前認為該作用與PTEN蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶活性有關(guān)，氧化失活成為調(diào)節(jié)PTEN活性的重要方式[20]。

PIP2是一個重要的內(nèi)源性的ATP敏感性鉀離子通道調(diào)節(jié)因子，因此PTEN可能通過PIP2間接使KATP通道開放，減少胰島素分泌。同時三磷酸脂肌醇激酶和Akt的活化還參與胰島素介導的葡萄糖攝入和糖原合成。本實驗也證實了在PTEN高度表達的細胞組細胞胰島素分泌量下降，細胞凋亡率增加。由此可以進一步說明PTEN與2型糖尿病疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

本課題以大鼠β細胞為研究對象，通過設(shè)定不同的培養(yǎng)條件，檢測相關(guān)指標，旨在通過研究波動高糖下PTEN對胰島細胞氧化應(yīng)激及凋亡相關(guān)因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以誘導細胞凋亡，通過細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化影響氧化應(yīng)激，胰島素分泌。本研究也證實了高糖后葡萄糖濃度恢復正常后胰島細胞凋亡率下降，胰島細胞功能恢復。PTEN通過脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白酪氨酸磷酸酶活性對細胞的生長及凋亡進行調(diào)節(jié)，PTEN能夠通過PI3K/Akt途徑促進細胞凋亡，同時氧化應(yīng)激也參與PTEN活性的表達，在胰島細胞，還能間接影響胰島素受體底物通路，減少胰島素分泌，影響胰島細胞功能。

綜上所述，胰島β細胞凋亡的機制十分復雜，尤其對于PTEN蛋白的研究還不夠深入，比如PTEN在誘導胰島細胞鈣離子內(nèi)流機制及胰島細胞高糖后恢復機制還有待研究。了解胰島β細胞凋亡的病因?qū)W機制對于人們更深入地認識糖尿病的發(fā)生發(fā)展，更好地防治糖尿病具有重要的臨床意義。

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Effects of intermittent high glucose on apoptosis and PTEN expression in islet cells

LI Xiao-lin, WANG Di-fei, SHAO Chen, FEI Ning, LI Guo-jiao, QU Bi-cheng

(DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:wdf8lm@163.com)

AIM: To investigate whether the increase in PTEN expression is related to apoptosis, and whether it is regulated by reactive oxygen species(ROS). METHODS: The rat islet cells were divided into constant low glucose group (group L), constant high glucose group (group H), glucose fluctuation group (group F), low glucose after high glucose group (group HL) and low glucose after fluctuation group (group FL). The ROS level, apoptotic rate, intracellular calcium, insulin release and PTEN protein expression were analyzed. RESULTS: Compared with groups H and L, the insulin secretion decreased, and intracellular calcium, ROS level, PTEN protein expression and apoptotic rate increased in group F (P<0.05). Compared with group H, the intracellular calcium, ROS level, PTEN protein expression and apoptotic rate in group HL decreased, but were still higher than those in group L (P<0.05). Compared with group F, the intracellular calcium, ROS level, PTEN protein expression and apoptotic rate in group FL decreased, but were still higher than those in group L (P<0.05). CONCLUSION: Glucose fluctuation can cause the apoptosis of islet cells more easily than constant high glucose. This may be related to the change of intracellular calcium and increase in oxidative stress which promotes PTEN expression. The recovery of glucose level to some extent relieves oxidative stress, decrease PTEN expression and reduce cell damage.

Glucose fluctuation; Islet cells; Oxidative stress; Apoptosis; PTEN

1000- 4718(2015)03- 0557- 05

2014- 04- 02

2015- 01- 08

遼寧省科技計劃(No.2012225079;No.2012225020)；沈陽市科技計劃項目(No.F13-221-9-02)

△通訊作者 Tel: 024-83283765; E-mail: wdf8lm@163.com

#現(xiàn)工作單位:沈陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科

R363.2; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.031