黎 佼， 張競之， 劉寧寧， 曾波航， 董 珺 △， 劉世明

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院， 2廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

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miR-486-5p通過抑制端粒酶活性促進人骨髓間充質干細胞衰老*

黎 佼1, 2， 張競之1， 劉寧寧2， 曾波航1， 董 珺1, 2△， 劉世明1, 2

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，2廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 研究年齡相關microRNA-486-5p (miR-486-5p) 對人骨髓間充質干細胞(hMSCs)衰老的調控作用。方法: 通過microRNA芯片和real-time PCR檢測供體年齡對hMSCs 中miR-486-5p表達的影響；通過轉染miR-486-5p模擬物或抑制物，過表達miR-486-5p或抑制其表達；用β-半乳糖苷酶染色檢測miR-486-5p對hMSCs衰老的影響；通過siRNA研究沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)對hMSCs端粒酶逆轉錄酶(TERT)、端粒酶活性及衰老的影響。結果: 隨供體年齡增加，hMSCs 中miR-486-5p的表達增加。過表達miR-486-5p可促進hMSCs衰老。相反，抑制miR-486-5p的表達可減少hMSCs的衰老。SIRT1及TERT隨供體年齡增加而表達下降，直接抑制SIRT1的表達可減少TERT表達，抑制端粒酶活性，促進細胞衰老。同時抑制miR-486-5p和SIRT1的表達，使miR-486-5p失去對hMSCs端粒酶活性及衰老的調控作用。結論: miR-486-5p通過抑制SIRT1，減少hMSCs端粒酶活性，促進hMSCs衰老。

人骨髓間充質干細胞； MicroRNA-486-5p； 衰老

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)中部分microRNA的表達隨供體年齡的增加而發(fā)生改變[1]。并且，這些年齡相關microRNA參與hMSCs多種功能的調控。例如隨年齡增加，miR-10a表達下調，并可通過抑制轉錄因子Klf4促進hMSCs分化[1]。而隨年齡增加，表達上調的miR-196a，可通過抑制同源框B7(homeobox B7，HOXB7)減少hMSCs增殖[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p在人脂肪組織來源的間充質干細胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hAT-MSCs)復制性衰老過程中，可促進細胞衰老，但其分子機制尚不明確[3]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p在hMSCs供體年齡增加、細胞自然衰老過程中表達增加?；趍iR-486-5p可能促進細胞衰老，本研究進一步探討了miR-486-5p調控hMSCs衰老的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通過廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，與患者簽訂知情同意書后，在心臟瓣膜病患者手術過程中吸取人骨髓5 mL。17～30歲志愿者定義為年青(young，Y)組，65～80歲志愿者定義為年老(old，O)組，排除腫瘤、乙肝、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清和Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 3000 轉染試劑和Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen)； SYBR Green熒光定量試劑盒和RNA逆轉錄試劑盒(Toyobo)；淋巴細胞分離液(MPBIO)；端粒酶活性檢測試劑盒(南京凱基公司)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(CST)；熒光定量PCR儀(ABI)。

2 方法

2.1 hMSCs的提取及鑒定 將人骨髓小心疊加于等體積的淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取分離液和血漿界面的云霧狀的單個核細胞層，用無血清IMDM懸浮后，以1 000 r/min離心。按2×109/m2密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后換液，貼壁細胞每3 d換液，待細胞融合度達80%以上時，胰酶消化傳代，第3代細胞用于實驗研究并通過流式細胞儀檢測細胞表面特異性抗原表達(CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166)[1]。

2.2 MicroRNA基因芯片檢測及real-time PCR檢測 分別選取年青組(17、20、25歲)及年老組(78、80、75歲)hMSCs送于北京博奧生物有限公司進行microRNA基因芯片檢測。用1 μg總RNA逆轉錄為cDNA。通過real-time PCR檢測miR-486-5p和沉默信息調節(jié)因子1(silence information regulator 1， SIRT1) mRNA的表達。分別選取U6及GAPDH作為內參照。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3 細胞轉染 miR-486-5p模擬物、抑制物和si-SIRT1及其相應的陰性對照均由上海吉瑪公司合成，具體序列見表2。其中轉染miR-486-5p陰性對照組定義為對照組1(control 1,C1)；轉染si-SIRT1陰性對照組定義為對照組2(control 2，C2);同時轉染miR-486-5p抑制物陰性對照及si-SIRT1陰性對照組定義為對照組3(control 3，C3)。hMSCs培養(yǎng)于 24 孔板，無血清培養(yǎng)過夜后，更換為新鮮無血清及抗生素培養(yǎng)基(500 μL/孔)。將小分子 RNA 稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入1 μL Lipofectamine RNAiMAX，輕柔混勻后室溫放置15 min；將 RNAiMAX與miRNA/siRNA的稀釋液加入 24 孔板的各孔細胞中，培養(yǎng)48 h按實驗需要處理細胞。

表2 MicroRNA與siRNA序列

2.4 β-半乳糖苷酶染色鑒定 通過β-半乳糖苷酶染色試劑盒，檢測不同預處理組中細胞衰老情況。hMSCs以3×108/m2密度培養(yǎng)，每孔加入500 μL 染色固定液，室溫固定10 min。PBS洗滌后，加入500 μL染色工作液，37 ℃孵育過夜。光學顯微鏡下觀察染色陽性細胞(每實驗組做3復孔，每孔隨機選取6個區(qū)域，ImageJ 軟件分析染色陽性細胞)。

2.5 端粒酶活性檢測 通過端粒酶檢測試劑盒，檢測不同預處理組中端粒酶活性。

2.6 Western blotting檢測蛋白表達 各實驗組細胞處理完畢后，加入細胞裂解液，4 ℃裂解30 min后收取蛋白液，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉移到NC膜上。用5%BSA封閉1 h，后分別加入SIRT1抗體(1∶200)及TERT抗體(1∶100)，4 ℃過夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，2組間的差異顯著性采用獨立樣本t檢驗，多組間的差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-486-5p隨供體年齡增加而表達上調

通過Affymetrixr Gene Chip 2.0 miRNA芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-486-5p隨供體年齡的增加而表達上調，見圖1A。通過real-time PCR檢測，我們進一步證實，年老組hMSCs中miR-486-5p表達量為年青組的1.86倍，見圖1B。

2 SIRT1及端粒酶活性隨供體年齡增加而表達下調

通過real-time PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)隨供體年齡的增加，SIRT1 mRNA和蛋白表達下調(O組mRNA表達量為Y組的38%)，TERT蛋白表達下調，見圖1C、D；端粒酶活性下降，O組為Y組的27%，見圖1G；細胞衰老增加，O組β半乳糖苷酶染色陽性率為Y組的2.90倍，見圖1E、F。

Figure 1.Changes of miR-486-5p and telomerase activity in aged hMSCs. A: miR-486-5p expression in young (Y) and old (O) hMSCs was determined by microarray analysis； B: miR-486-5p expression in Y and O hMSCs determined by real-time PCR; C: SIRT1 mRNA expression in Y and O hMSCs; D: SIRT1 and TERT protein expression in Y and O hMSCs; E, F: representive images of β-galactosidase staining (arrows indicate positive cells,×200) and quantification of cell senescence; G: telomerase activity in Y and O hMSCs. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs O.

3 miR-486-5p促進hMSCs衰老

轉染miR-486-5p模擬物，可在hMSCs中過表達miR-486-5p(為對照組的10.93倍)；相反，轉染miR-486-5p抑制物，可抑制miR-486-5p的表達(為對照組的25%)，見圖2A。過表達miR-486-5p后，通過β-半乳糖苷酶染色檢測，我們發(fā)現(xiàn)hMSCs細胞衰老增加(為對照組的2.34倍)；相反，抑制miR-486-5p表達后，hMSCs衰老減少(為對照組的34%)，見圖3A、B。

4 miR-486-5p通過抑制SIRT1減少端粒酶活性

通過real-time PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)，通過轉染miR-486-5p模擬物在hMSCs中過表達miR-486-5p時，SIRT1表達下調(為對照組的29%)，TERT蛋白表達下調，端粒酶活性下降(為對照組的57%)，而在hMSCs中抑制miR-486-5p表達時，SIRT1表達升高(為對照組的4.43倍)，TERT蛋白表達增加，端粒酶活性上升(為對照組的3.15倍)，通過si-SIRT1，我們可在hMSCs中直接抑制SIRT1 mRNA及蛋白的表達(mRNA為對照組的13%)，直接抑制SIRT1的表達后，hMSCs 中TERT蛋白表達下調，端粒酶活性下降(為對照組的46%)，衰老增加(β半乳糖苷酶染色檢測，為對照組的2.29倍)。而在hMSCs中同時抑制miR-486-5p及SIRT1表達后，使抑制miR-486-5p所引起的端粒酶活性上升、細胞衰老減少的作用消失，見圖2、3。

Figure 2.Effects of miR-486-5p and SIRT1 on hMSC senescence. A: up-regulated miR-486-5p expression in hMSCs by miR-486-5p mimic (M) and down-regulated miR-486-5p expression in hMSCs by miR-486-5p inhibitor (I)； B: the mRNA expression of SIRT1 in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, si-SIRT1 (s), or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1 (I+s)； C: the protein expression of SIRT1 and TERT in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, or si-SIRT1; D: telomerase activity in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, si-SIRT1, or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1. C1～3: controls. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs C1; ▲P<0.05 vs C2.

Figure 3.β-galactosidase staining for detecting effects of miR-486-5p and SIRT1 on hMSC senescence. A: representive images of β-galactosidase staining (arrows indicate positive cells，×200) in hMSCs transfected by miR-486-5p mimic (M), miR-486-5p inhibitor (I), si-SIRT1 (s), or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1 (I+s)； B: quantitative analysis of β-galactosidase staining positive cells. C1～3: controls. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs C1; ▲P<0.05 vs C2.

討 論

本課題組前期研究證實，供體年齡影響了MSCs的增殖能力、分化能力及細胞的衰老[4]；隨供體年齡差異表達的microRNA，參與調控年齡因素引起的hMSCs功能改變[1]。本研究承前啟后，進一步探討了隨供體年齡差異表達microRNA——miR-486-5p對hMSCs衰老的調控作用及其機制。我們發(fā)現(xiàn)miR-486-5p可通過抑制SIRT1減少hMSCs端粒酶活性，促進hMSCs衰老。

研究證實miR-486-5p參與細胞增殖、遷移、凋亡、衰老和分化等過程的調控。例如：在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比腫瘤組織中miR-486-5p的表達明顯下降。而過表達miR-486-5p可通過抑制ARHGAP5，導致細胞增殖能力下降，從而抑制肺癌細胞遷移、侵襲和肺癌體內轉移[5]。而在人成纖維細胞系(IMR90)復制性衰老中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p可通過促進DNA雙鏈斷裂以及增加氧自由基聚集，抑制細胞增殖，促進細胞衰老[6]。在hAT-MSCs復制性衰老的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，miR-486-5p可促進細胞衰老，抑制細胞增殖并抑制其向脂肪細胞、成骨細胞分化[3]。與此結果類似，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p的表達隨hMSCs供體年齡的增加而上調，miR-486-5p可通過抑制細胞端粒酶活性，促進hMSCs衰老。

Kim 等[3]在hAT-MSCs的研究中，證實SIRT1為miR-486-5p的靶基因，miR-486-5p通過抑制其表達發(fā)揮細胞調控作用。而在前期研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1參與多種細胞功能的調控，在機體生命周期調控中起重要作用。例如在對P53、FOXOs、E2F1、Ku70去乙酰化，應激反應，DNA修復，細胞凋亡、衰老，基因組穩(wěn)定性等機制研究中，均已證實SIRT1的調控作用[7-8]。在肝癌中的研究更是進一步發(fā)現(xiàn)，SIRT1在維持端粒穩(wěn)定性中起重要作用。在肝癌細胞中抑制SIRT1的表達，可抑制端粒酶反轉錄酶及PTOP的表達，引起端粒功能下降，誘導細胞衰老或者凋亡，最終導致細胞增殖下降[9]。Yamashita等[9]在人臍帶成纖維細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過促進TERT核心啟動子中c-myc的表達，激活c-myc轉錄，促進端粒酶逆轉錄酶轉錄，減少細胞衰老。同樣，我們的研究證實，SIRT1隨供體年齡的增加而表達下調。進一步的功能實驗證實，SIRT1表達下降引起的端粒酶活性下降是促進hMSCs衰老的主要因素。

我們的研究證實miR-486-5p隨hMSCs供體年齡的增加而表達上調，從而抑制了其靶基因SIRT1的表達，導致hMSCs端粒酶活性下降，衰老增加。本課題闡述了miR-486-5p調控hMSCs衰老的機制，為年齡相關microRNAs及hMSCs的運用提供了理論基礎及新的研究方向。

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miR-486-5p enhances senescence of human mesenchymal stem cells by decreasing telomerase activity

LI Jiao1, 2, ZHANG Jing-zhi1, LIU Ning-ning2, ZENG Bo-hang1, DONG Jun1, 2, LIU Shi-ming1, 2

(1TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,2GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:dj330@139.com)

AIM: To investigate the effects of microRNA-486-5p (miR-486-5p) on the senescence of human mesenchymal stem cells (hMSCs). METHODS: The expression of miR-486-5p was determined by miRNA arrays and real-time PCR. By transfection of miR-486-5p mimic or inhibitor, up-regulation or down-regulation of miR-486-5p expression in hMSCs was established. The effect of miR-486-5p and silence information regulator 1 (SIRT1) on hMSC telomerase activity and senescence were detected by β-galactosidase staining. RESULTS: The expression of miR-486-5p was up-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. Up-regulation of miR-486-5p resulted in increasing senescence of hMSCs. Conversely, down-regulation of miR-486-5p resulted in decreasing cell senescence. The expression of SIRT1 and telomerase reverse transcriptase (TERT) was down-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. Directly repression of SIRT1 expression inhibited the hMSC TERT protein expression and telomerase activity, but increased cell senescence. The regulation of miR-486-5p on hMSC senescence was attenuated by inhibiting the expression of miR-486-5p and SIRT1 together. CONCLUSION: miR-486-5p enhances senescence of hMSCs by decreasing the expression of SIRT1 and telomerase activity.

Human mesenchymal stem cells; MicroRNA-486-5p; Senescence

1000- 4718(2015)03- 0547- 05

2014- 09- 23

2014- 11- 09

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No. 81401156)； 廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(No. 20141A011088)； 廣州醫(yī)科大學博士科研項目(No. 2013C49)

△通訊作者 Tel: 020-34153522; E-mail: dj330@139.com

R363； R339.3+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.029