張艷艷， 趙 蕾， 謝云霞， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

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FAT/CD36在高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪組織炎癥中的作用*

張艷艷， 趙 蕾△， 謝云霞， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

目的： 探討脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶/白細(xì)胞分化抗原36 (fatty acid translocase/CD36，F(xiàn)AT/CD36)在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織炎癥中的作用。方法: 將6周齡雄性C57BL/6J小鼠分別隨機(jī)分為普通飲食組和高脂飲食組，喂養(yǎng)14周后，ELISA測(cè)定血清游離脂肪酸(FFA)含量，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量 PCR和Western blotting檢測(cè)脂肪組織中FAT/CD36及炎癥/趨化因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1)mRNA和蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，比較高脂喂養(yǎng)14周的野生型小鼠和CD36基因敲除小鼠的脂肪組織炎癥反應(yīng)情況。結(jié)果: 與普通飲食組相比，高脂飲食能增強(qiáng)C57BL/6J小鼠脂肪組織的FAT/CD36及炎癥/趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在脂肪組織的浸潤(rùn)。與高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠相比，CD36 基因敲除小鼠的脂肪組織炎癥因子、趨化因子表達(dá)明顯降低，脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少。結(jié)論: 高脂飲食通過上調(diào)脂肪組織FAT/CD36的表達(dá)激活了脂肪組織炎癥。

脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶/白細(xì)胞分化抗原36； 高脂飲食； 脂肪組織； 炎癥

隨著人民生活水平的提高及運(yùn)動(dòng)量的減少，肥胖、糖尿病、脂肪肝、高血壓、血脂異常等代謝性疾病已成為嚴(yán)重影響我國人民健康的多發(fā)病及常見病。近期的研究表明炎癥反應(yīng)是肥胖及其相關(guān)代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[1]。2006年Hotamisligil[2]首次提出“代謝性炎癥”的概念，主要指由營(yíng)養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物所觸發(fā)、多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的全身性、系統(tǒng)性的低峰度炎癥。

脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶/白細(xì)胞分化抗原36(fatty acid translocase/CD36, FAT/CD36)是一個(gè)88 kD的膜糖蛋白，屬于B 類清道夫受體家族，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞(肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞等)，尤其在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)[3]。FAT/CD36不僅能直接介導(dǎo)脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，還能識(shí)別眾多致炎性的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，如氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、非修飾的脂蛋白和淀粉樣蛋白等，被認(rèn)為是將機(jī)體的代謝和炎癥這兩大過程有機(jī)聯(lián)合在一起的重要“橋梁”[4]。既往研究表明脂肪組織是代謝性炎癥產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[3-5]。然而，F(xiàn)AT/CD36在脂肪組織代謝性炎癥中的作用目前國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。因此本研究擬應(yīng)用C57BL/6J小鼠、野生型(widetype，WT)/CD36基因敲除(CD36 knockout，CD36 KO)小鼠作為動(dòng)物模型，觀察高脂飲食對(duì)脂肪組織FAT/CD36表達(dá)和炎癥反應(yīng)的影響，并初步探討CD36基因缺失對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠的脂肪組織炎癥的作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

WT、CD36 KO小鼠由美國Maria Febbraio教授惠贈(zèng)，C57BL/6J小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

2 主要試劑

普通飼料(normal chow diet，NCD)和高脂飼料購自Research Diets；Trizol RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix均購自TaKaRa；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購自凱基公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋公司；游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)測(cè)定試劑盒購自浙江東甌公司；CD36、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)Ⅰ抗購自Santa Cruz；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗體購自Millipore；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1 (macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)抗體購自上海生工生物工程公司；β-肌動(dòng)蛋白 (β-actin)Ⅰ抗和Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司；F4/80 Ⅰ抗購自Biolegend；硝酸纖維膜和化學(xué)發(fā)光試劑購自GE。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物選擇與分組 將6 周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為普通飲食(NCD)組和高脂飲食(high-fat diet，HFD)組，喂養(yǎng)14周。并分別選取8只6 周齡的雄性WT和CD36 KO小鼠，給予高脂喂養(yǎng)14周。

3.2 Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA的表達(dá) Trizol提取細(xì)胞總RNA。將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，保存于-20 ℃。再取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件： 95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

3.3 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 試劑盒提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h后，將膜用 I 抗(CD36、TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1和β-actin)室溫下孵育2 h，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫下孵育1 h。最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)信號(hào)，并用Quantity One軟件對(duì)條帶的強(qiáng)度(亮度×面積)進(jìn)行定量。

3.4 免疫組織學(xué)染色 按照試劑盒說明書，采用2步法檢測(cè)脂肪組織內(nèi)F4/80蛋白表達(dá)，DAB顯色。I抗?jié)舛?∶ 200。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

3.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 按照試劑盒說明書，檢測(cè)血清中FFA含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用t-test對(duì)兩樣本進(jìn)行比較檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高脂飲食能促進(jìn)C57BL/6J小鼠的高脂肪酸血癥和脂肪組織CD36表達(dá)

不同飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠14周，收集動(dòng)物血清和脂肪組織樣本，用ELISA檢測(cè)小鼠血清FFA，用real-time PCR檢測(cè)CD36 mRNA表達(dá)，Western blotting及免疫組織化學(xué)檢測(cè)C57BL/6J小鼠脂肪組織CD36蛋白的表達(dá)。如圖1所示，與普通飲食組相比，高脂飲食可以使小鼠血清的FFA明顯增加，使脂肪組織內(nèi)的CD36 mRNA約升高了3.23±0.64倍，CD36蛋白表達(dá)約升高了0.49±0.10倍差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 高脂飲食能促進(jìn)C57BL/6J小鼠脂肪組織的炎癥反應(yīng)

與普通飲食組相比，高脂飲食可使C57BL/6J小鼠脂肪組織內(nèi)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA分別約升高0.78±0.46、1.69±0.65、0.94±0.52倍(P<0.05)；趨化因子MCP-1和 MIP-1 mRNA分別約升高0.89±0.20、1.94±0.38倍(P<0.05)；C57BL/6J小鼠脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趨化因子MCP-1、MIP-1的蛋白表達(dá)也呈明顯升高趨勢(shì)(P<0.05)，同時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80染成黃色，箭頭指示處)，見圖2。

Figure 1.HFD upregulated CD36 expression in the adipose tissues of C57BL/6J mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs NCD.

3CD36基因敲除可以減弱高脂誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)

高脂喂養(yǎng)CD36 KO小鼠和WT小鼠14周后收集脂肪組織并做相應(yīng)檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)CD36 KO小鼠的脂肪組織炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA含量分別為WT小鼠的56.0%±12.0%、35.0%±9.7%和27.0%±5.1%(P<0.05)；趨化因子MCP-1和 MIP-1的 mRNA表達(dá)為對(duì)照小鼠的59%±15%和43%±12%(P<0.05)；同時(shí)CD36 KO小鼠脂肪組織炎癥/趨化因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1的蛋白表達(dá)也明顯降低(P<0.05)，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80染成黃色細(xì)胞較少)，見圖3。

Figure 3.The expression of cytokine and chemokine in the adipose tissues of WT and CD36 KO mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs WT mice.

討 論

目前學(xué)界關(guān)于肥胖、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、脂代謝紊亂、高血壓等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制的研究報(bào)道很多，代謝性炎癥在其發(fā)生中的核心作用也越來越得到公認(rèn)[6]，但是代謝性炎癥發(fā)生的具體分子機(jī)制目前尚未闡明。

既往研究提示，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FAT/CD36可能是細(xì)胞炎癥反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵蛋白[7]。在對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茨海默氏病的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CD36蛋白與其配體ox-LDL結(jié)合后，能募集TLR4/6受體形成CD36/TLRs多聚體，并誘導(dǎo)TLR4/6磷酸化，進(jìn)而激活NF-kappaB通路，釋放氧化應(yīng)激產(chǎn)物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[8]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠血清中的FFA含量增高，且脂肪組織CD36的mRNA和蛋白表達(dá)較普通飲食組均明顯增加，同時(shí)伴有脂肪組織炎癥因子/趨化因子表達(dá)水平及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的顯著增加。推測(cè)高脂條件下，小鼠血清中CD36的配體(如游離脂肪酸)含量增加，進(jìn)而上調(diào)脂肪組織的CD36表達(dá)；CD36通路活化后可以激活NF-κB通路，產(chǎn)生并分泌大量的炎癥因子和趨化因子，從循環(huán)中募集巨噬細(xì)胞，促使大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到脂肪組織中，活化的巨噬細(xì)胞又可以進(jìn)一步產(chǎn)生和釋放炎癥/趨化因子，放大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致脂肪組織代謝性炎癥的發(fā)生。病理狀態(tài)下，脂肪組織所產(chǎn)生和分泌的多種炎癥/趨化因子，可以通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌網(wǎng)狀信號(hào)旁路作用于脂肪組織局部和胰島、肌肉、肝臟等全身多種細(xì)胞，從而導(dǎo)致了胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生[9]。

為進(jìn)一步確證脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FAT/CD36是否在這一高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)中扮演了重要角色，我們比較了WT和CD36 KO小鼠在高脂喂養(yǎng)條件下的炎癥情況。結(jié)果表明：CD36 KO小鼠脂肪組織中的炎癥反應(yīng)較WT小鼠顯著降低，從而提示高脂誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織代謝性炎癥的產(chǎn)生依賴于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FAT/CD36通路。

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Role of FAT/CD36 in high-fat diet-induced adipose tissue inflammation

ZHANG Yan-yan, ZHAO Lei, XIE Yun-xia, CHEN Ya-xi, RUAN Xiong-zhong

(CentreforLipidResearch,ChongqingKeyLaboratoryofLipidandGlucoseMetabolism,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:laleinlz@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of fatty acid translocase/CD36 (FAT/CD36) in adipose tissue inflammation induced by a high-fat diet. METHODS: C57BL/6J mice were fed with a normal-chow diet (NCD) or a high-fat diet (HFD) for 14 weeks. The content of free fatty acid (FFA) in the serum was measured by ELISA. The expression of CD36, cytokines and chemokines at mRNA and protein levels in the adipose tissues was determined by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Immunohistochemical staining was used to examine the macrophages infiltration in the adipose tissues. The inflammatory responses inCD36 knockout mice and wild type mice with high-fat diet were analyzed. RESULTS: The levels of FAT/CD36 were higher in HFD group than that in NCD group. HFD feeding enhanced the mRNA and protein expression of IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 and MIP-1, as well as promoted macrophage infiltration in the adipose tissues. Interestingly, as fed with HFD, the expression of cytokines/chemokines and macrophage infiltration were significantly reduced in adipose tissues of theCD36 knockout mice, compared with the wild type mice. CONCLUSION: High-fat diet promotes adipose tissue inflammation in the mice in a FAT/CD36-dependent manner.

Fatty acid translocase/CD36; High-fat diet; Adipose tissues; inflammation

1000- 4718(2015)03- 0463- 05

2014- 09- 29

2014- 12- 09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270493； No. 81200567)

△通訊作者 Tel： 023-68486780; E-mail: laleinlz@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.014