韋尉元， 曹穩(wěn)瓏， 張笑石， 詹澤栩， 余 晗， 謝玉波， 肖 強△

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 1胃腸腺體外科， 2麻醉科，廣西 南寧 530021)

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MicroRNA-1284在胃癌中的表達及其作用機制研究*

韋尉元1， 曹穩(wěn)瓏1， 張笑石1， 詹澤栩1， 余 晗1， 謝玉波2， 肖 強1△

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1胃腸腺體外科，2麻醉科，廣西 南寧 530021)

目的： 探討microRNA-1284(miR-1284)與胃癌的相關(guān)性及分子機制。方法: Real-time PCR檢測63例胃癌患者的胃癌組織和匹配周圍正常胃組織中miR-1284的表達水平及分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。通過慢病毒載體的構(gòu)建及包裝生成上調(diào)miR-1284慢病毒載體并轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，上調(diào)miR-1284后采用real-time PCR驗證細胞miR-1284表達水平，CCK-8法檢測細胞活性，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，生物信息學軟件預測miR-1284潛在的靶基因,real-time PCR測定靶基因JAG1表達水平，Western blotting檢測JAG1、Notch1和NF-κB的表達水平。結(jié)果: 66.67%胃癌患者胃癌組織miR-1284表達明顯低于正常胃組織(P<0.05)，miR-1284的表達在不同年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但在不同組織學分級患者間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LV-NC-GFP組和control組比較，LV-miR-1284組的miR-1284表達水平和細胞凋亡顯著升高，細胞周期阻滯于G0/G1期， 細胞活性和細胞遷移能力減弱，JAG1、Notch1和NF-κB的表達水平降低，均有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論: miR-1284可能通過調(diào)控其靶基因JAG1而發(fā)揮抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。

微小RNA-1284； 胃腫瘤； 慢病毒載體； JAG1

胃癌是常見的消化道腫瘤，雖然目前采取了包括手術(shù)、化療、放療以及其它綜合性治療措施，但胃癌的治療效果和臨床預后仍然不是很理想?，F(xiàn)今我們對于胃癌的發(fā)病機理尚缺乏全面深入的了解，臨床上也缺乏特異性的胃癌腫瘤標記物，已被發(fā)現(xiàn)的胃癌的癌基因或抑癌基因的數(shù)量也有限。近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)具有高效調(diào)控癌基因或抑癌基因的生物學特性，且約有50%人類miRNA基因定位于與腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域[1]。因此，近年來其與腫瘤的相關(guān)性備受關(guān)注。大量研究表明，miRNA在不同的腫瘤中顯示各自特異的表達譜，與腫瘤的臨床病理特征、轉(zhuǎn)移和預后等密切相關(guān)[2]。有研究表明，miRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系[3]。最新的胃癌miRNA表達譜芯片篩選了與胃癌相關(guān)的多個miRNA，其中Chen等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達少，提示miR-1284極可能在胃癌中表達異常并發(fā)揮調(diào)控作用。為了深入研究miR-1284在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過熒光定量PCR方法檢測驗證miR-1284在胃癌患者腫瘤組織的表達情況，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，明確其在胃癌中的意義；并通過構(gòu)建目的miR-1284慢病毒載體，轉(zhuǎn)染胃癌細胞，觀察和探討miR-1284在胃癌中的作用及可能作用機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

兔抗人JAG1、Notch1、NF-κB和GAPDH抗體購自CST，鼠抗兔Ⅱ抗IRDye 800購自Li-Cor，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴增試劑盒購自TaKaRa。慢病毒顆粒LV-hsa-miR-1284及其陰性對照LV-NC-GFP的構(gòu)建、包裝和鑒定由上海吉凱公司完成。

2 方法

2.1 收集病理標本 選擇2013～2014年在本院接受胃癌切除手術(shù)的63例胃癌患者，所納入的患者均簽訂了知情同意書。胃癌組織以及匹配癌旁正常組織(距離癌組織4 cm)各取直徑為0.5 cm的標本。手術(shù)切除后，取的新鮮標本立即置于液氮中冷凍保存。所有胃癌標本均經(jīng)過病理診斷確認。

2.2 熒光定量PCR檢測miR-1284在胃癌組織中的表達 采用Trizol 法提取病理標本總RNA并檢測RNA的純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應均嚴格按照TaKaRa公司提供的說明書，以U6作為內(nèi)參照進行相對定量，每組設(shè)3 復孔，在Roche實時定量熒光PCR儀上進行檢測。miR-1284的上游引物序列為5’-CGTCTATACAGACCCTGGCTTTTC-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6的上游引物序列為 5’-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物序列為5’-CACTATTGCGGGTCTGC-3’；采用2-ΔΔCt法計算miR-1284的相對表達量，ΔCt=CtmiR-1284-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁正常組織。

2.3 細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)SGC-7901細胞(購自中國科學院上海細胞庫)，取對數(shù)生長期細胞重懸，以3×105cells/well接種于6孔板。待細胞鋪滿孔50%～60%時，慢病毒顆粒LV-hsa-miR-1284和LV-NC-GFP(每孔6×109TU)轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞，分別命名為LV-miR-1284組和LV-NC-GFP組，未轉(zhuǎn)染任何病毒載體的細胞為空白對照組(control)。轉(zhuǎn)染72 h后收集各組的細胞用于后續(xù)實驗。并采用熒光定量PCR鑒定miR-1284在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。

2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 取上述各組實驗對數(shù)生長期的細胞用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至2×107/L。以每孔100 μL接種于96孔板，每組設(shè)3個復孔，共鋪5個板。置于恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)。分別于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h各檢測1塊板，檢測時每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后，在450 nm波長處測定吸光度(A)。

2.5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的周期和凋亡 取上述各組實驗的細胞，每個樣本收集細胞數(shù)1×106個，用PBS洗滌細胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，棄上清。在每管細胞中加入體積分數(shù)為70%預冷乙醇500 μL吹打混勻固定過夜，4 ℃保存，染色前用PBS洗去乙醇固定液2次(2 000 r/min，5 min)，棄上清。在每管加100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上流式細胞儀檢測周期。取上述各組實驗的細胞，每個樣本收集細胞數(shù)5×106個，用PBS洗滌細胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，棄上清。加100 μL的binding buffer 懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V-PE混勻后，再加入5 μL 7-AAD 混勻。室溫下避光反應15 min。再加入400 μL的binding buffer，上流式細胞儀檢測凋亡。

2.6 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 取上述各組實驗的細胞懸液，以每孔5×104個分別相應地接種到6孔板中的實驗組、陰性對照組、空白對照組，每組細胞設(shè)3個復孔。37 ℃孵育24 h，用200 μL移液器槍頭于培養(yǎng)板底部劃“一”字痕，PBS沖洗2遍，徹底洗脫懸浮細胞。培養(yǎng)至0 h、24 h、48 h和72 h 應用相差顯微鏡拍攝劃痕邊緣進展情況，應用NIH 圖像處理軟件分析細胞遷移程度。

2.7 生物信息學軟件預測靶基因 利用TargetScan、miRDB和microRNA這3個預測軟件網(wǎng)站，綜合分析相關(guān)因素，篩選出目的miR-1284可能的潛在靶基因，結(jié)果均提示miR-1284可以與JAG1 mRNA的3’UTR區(qū)相結(jié)合，JAG1為可能的靶基因，見圖5。

2.8 熒光定量PCR法檢測JAG1 mRNA在各組細胞中的表達 方法同步驟2.2，以GAPDH作為內(nèi)參照，內(nèi)參照的上游引物序列為 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；JAG1的上游引物序列為 5’-GATTGCTGCCGTTGCAGAAGTA-3’，下游引物序列為5’-AGCAACAGATCCAAGCCACAGTTA-3’；采用2-ΔΔCt法計算比較JAG1在各組細胞的相對表達量。

2.9 Western blotting 檢測靶基因及其下游相關(guān)基因蛋白在各組細胞中的表達 按照蛋白提取試劑盒說明提取各組細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白含量。取150～250 μg蛋白徑10% SDS-PAGE分離，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用 I 抗稀釋液分別加入兔抗人JAG1、Notch1、NF-κB和GAPDH抗體，于4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌膜5次，再用含羊抗兔 II 抗IRDye 800(1∶10 000)II抗稀釋液常溫孵育1 h，用TBST洗滌膜5次，應用 Odyssey 3.0儀器(Li-Cor公司)掃膜顯影，以GAPDH為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-1284在胃癌和匹配癌旁正常組織的表達

63例胃癌患者中，21例胃癌患者的胃癌組織miR-1284表達量高于癌旁正常組織，占33.33%；42例胃癌患者的胃癌組織miR-1284表達量低于癌旁正常組織，占66.67%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2 miR-1284與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

miR-1284的表達量與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但miR-1284的表達量與胃癌的組織學分級有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 miR-1284與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 熒光定量PCR檢測胃癌SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后miR-1284的表達

轉(zhuǎn)染LV- miR-1284組、LV-NC-GFP組和control組的miR-1284相對表達量用Ct值表示分別為-10.31±0.09、-14.02±1.04和-14.69±1.19，其中Lv-miR-1284組的表達量高于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而陰性對照組和空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)。

4 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后胃癌SGC-7901細胞活力的變化

CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LV-miR-1284后，隨著時間的增長，細胞的活力明顯降低。在第72 h和96 h時，LV-miR-1284組與LV-NC-GFP組和control組比較，細胞活力有顯著差異(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of miR-1284 on the activity of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

5 miR-1284引起胃癌SGC-7901細胞凋亡與細胞周期阻滯

轉(zhuǎn)染72 h 后，檢測細胞凋亡顯示，與LV-NC-GFP組和control組比較，LV-miR-1284組凋亡細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。檢測細胞周期顯示，在G0/G1期細胞，與LV-NC-GFP組和control組比較，LV-miR-1284組于G0/G1期細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The effect of miR-1284 on the apoptotic rate of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

Figure 3.The effect of miR-1284 on the cell cycle distribution of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

6 miR-1284對胃癌SGC-7901細胞遷移能力的作用

劃痕實驗結(jié)果提示，上調(diào)胃癌細胞miR-1284表達后，48 h時 LV-miR-1284組細胞遷移距離為(312.42±16.87)μm，LV-NC-GFP組為(123.63±17.69)μm，control組為(118.95±15.86)μm，對照組較LV-miR-1284組遷移距離明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of miR-1284 on the migration of gastric cancer SGC-7901 cells (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

7 生物信息學軟件預測靶基因結(jié)果和熒光定量PCR檢測其在各組細胞中的表達

生物信息學軟件預測結(jié)果提示，miR-1284可以與JAG1 mRNA的3’UTR區(qū)相結(jié)合，JAG1為可能的靶基因，見圖5。熒光定量PCR檢測結(jié)果用Ct值表示，與LV-NC-GFP組(-12.42±0.10)和control組(-12.69±0.08)比較，JAG1 mRNA的表達量在轉(zhuǎn)染LV-miR-1284組(-13.28±0.25)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Figure 5.The results of bioinformatics software seaching to predict the target gene of miR-1284.

8 Western blotting 檢測JAG1及其下游相關(guān)蛋白表達情況

Western blotting的實驗結(jié)果表明，與LV-NC-GFP組和control組比較，上調(diào)胃癌SGC-7901細胞miR-1284表達后，LV- miR-1284組JAG1、Notch1和NF-κB表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The comparison of related protein levels in gastric cancer SGC-7901 cells with different treatments. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

討 論

MicroRNA是一類小的非編碼RNA分子，是Lee 等[5]于1993 年在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)的，其長度約為21～25個堿基組成，廣泛存在于真核生物中。大多數(shù)已知的miRNA分子都和基因的負向調(diào)節(jié)相關(guān)，其主要通過2種機制調(diào)節(jié)蛋白的表達，一種途徑是當miRNA 和編碼蛋白質(zhì)的mRNA 幾乎完全配對時，miRNA 誘導mRNA 降解；另一種途徑是當miRNA 和編碼蛋白質(zhì)的mRNA 不完全配對時，miRNA 通過不完全的堿基配對結(jié)合mRNA 的3′UTR，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因翻譯，從而對細胞的增殖、周期、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡發(fā)揮調(diào)控作用[6]。胃癌中存在眾多miRNA表達的異常，其可能通過對腫瘤相關(guān)靶基因的調(diào)控發(fā)揮作用[7-8]。因此，對胃癌中表達異常microRNA進行的研究可為胃癌的臨床診治提供重要的科學理論。

用最新的胃癌miRNA表達譜芯片篩選了與胃癌相關(guān)的多個miRNA，Chen等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達少，提示miR-1284極可能在胃癌中表達異常并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。本文首先研究了miR-1284表達水平與胃癌的相關(guān)性，應用熒光定量PCR法對胃癌及匹配癌旁正常組織的miR-1284表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌組織表達量顯著低于癌旁正常組織，說明正常胃組織普遍高表達。miR-1284表達量與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)，但與組織分化程度有關(guān)，且在低分化組織中存在高比例的高表達。進一步在細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-1284后胃癌SGC-7901細胞的活力受抑制，細胞周期阻滯于G0/G1期，促進細胞凋亡，并抑制細胞遷移。本研究結(jié)果顯示miR-1284與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，miR-1284過表達抑制細胞遷移，而Chen等[4]的研究表明miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達少，與我們細胞實驗結(jié)果一致，這可能需要更大的臨床標本驗證。miR-1284在胃癌低分化組織較中高分化組織表達量高，這可能與本研究樣本中高分化胃癌組織患者所占數(shù)量較少有關(guān)。為了進一步探討miR-1284可能存在的抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，我們利用TargetScan、miRDB和microRNA 這3個預測軟件網(wǎng)站，預測miR-1284可能的下游靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAG1為其可能的靶基因。而JAG1在多種腫瘤中高表達，且與腫瘤的預后密切相關(guān)，在腎上腺皮質(zhì)癌、乳腺癌中JAG1的表達越高，其預后越差[9-10]。同時有研究表明JAG1是Notch1的激活配體，激活JAG1-Notch1信號通路引起卵巢癌細胞耐藥[11]，下調(diào)JAG1可引起Notch1功能活性下降[12]。也有研究表明Notch家族是NF-κB的一個基本上游調(diào)控因子[13]，且也有研究顯示通過阻滯Notch1/NF-κB信號通路抑制胰腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。而我們研究結(jié)果顯示miR-1284過表達時，JAG1在mRNA和蛋白水平上表達量都降低，結(jié)合生物信息學序列配對情況，提示JAG1極可能是miR-1284的直接靶基因，但仍需雙螢光素酶報告基因的技術(shù)驗證。本研究發(fā)現(xiàn)JAG1表達下調(diào)后，其下游Notch1和NF-κB蛋白表達量降低。而大量研究表明NF-κB表達降低可以促進胃癌細胞凋亡[15]，同時也可以抑制胃癌細胞增殖和遷移[16]，而細胞周期阻滯，進而細胞分裂受阻引起細胞增殖受抑制。這些結(jié)果說明miR-1284在胃癌SGC-7901過表達后，極有可能通過抑制JAG1/Notch1/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，調(diào)控JAG1基因可能是miR-1284抑制胃癌生長的重要機制，上調(diào)miR-1284的表達，為胃癌的生物學防治提供了一個新的潛在靶標，值得深入研究和進一步驗證。

[1] Mishra PJ, Mishra PJ, Banerjee D, et al. MiRSNPs or MiR-polymorphisms, new players in microRNA mediated regulation of the cell: Introducing microRNA pharmacogenomics[J]. Cell Cycle, 2008, 7(7):853-858.

[2] Finnerty JR, Wang WX, Hébert SS, et al. The miR-15/107 group of microRNA genes: evolutionary biology, cellular functions, and roles in human diseases[J]. J Mol Biol, 2010,402(3):491-509.

[3] 林巧愛，李玲玲，鞏文辭，等. miR-143在胃癌中的表達及其臨床病理意義[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(9):1674-1678.

[4] Chen W, Tang Z, Sun Y, et al. miRNA expression profile in primary gastric cancers and paired lymph node metastases indicates that miR-10a plays a role in metastasis from primary gastric cancer to lymph nodes[J]. Exp Ther Med, 2012, 3(2):351-356.

[5] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. TheC.elegansheterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity tolin-14[J]. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[6] 羅子華，于曉峰，鄒 健. 非編碼RNA對腫瘤的調(diào)控機制[J]. 國際消化病雜志, 2013, 33(2):97-100.

[7] 張小靜，黃偉玲，高 燕，等. 胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的篩選及生物信息學分析[J]. 腫瘤, 2014, 34(6):507-513.

[8] Song F, Yang D, Liu B, et al. Integrated microRNA network analyses identify a poor-prognosis subtype of gastric cancer characterized by the miR-200 family[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(4):878-889.

[9] Simon DP, Giordano TJ, Hammer GD. Upregulated JAG1 enhances cell proliferation in adrenocortical carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(9):2452-2464.

[10]Reedijk M, Pinnaduwage D, Dickson BC, et al. JAG1 expression is associated with a basal phenotype and recurrence in lymph node-negative breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2008, 111(3):439-448.

[11]Liu MX, Siu MK, Liu SS, et al. Epigenetic silencing of microRNA-199b-5p is associated with acquired chemoresistance via activation of JAG1-Notch1 signaling in ovarian cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(4):944-958.

[12]Cohen B, Shimizu M, Izrailit J, et al. Cyclin D1 is a direct target of JAG1-mediated Notch signaling in breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010, 123(1):113-124.

[13]Schwarzer R, D?rken B, Jundt F. Notch is an essential upstream regulator of NF-κB and is relevant for survival of Hodgkin and Reed-Sternberg cells[J]. Leukemia, 2012, 26(4):806-813.

[14]Wang Z, Banerjee S, Li Y, et al. Down-regulation of Notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-κB, vascular endothelial growth factor, and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(5):2778-2784.

[15]Sha M, Ye J, Zhang LX, et al. Celastrol induces apoptosis of gastric cancer cells by miR-21 inhibiting PI3K/Akt-NF-κB signaling pathway[J]. Pharmacology, 2014, 93(1-2):39-46.

[16]Zhang J, Kou YB, Zhu JS, et al. Knockdown of HMGB1 inhibits growth and invasion of gastric cancer cells through the NF-κB pathwayinvitroandinvivo[J]. Int J Oncol, 2014, 44(4):1268-1276.

Expression of microRNA-1284 in gastric cancer and underlying mechanism

WEI Wei-yuan1, CAO Wen-long1, ZHANG Xiao-shi1, ZHAN Ze-xu1, YU Han1, XIE Yu-bo2， XIAO Qiang1

(1DepartmentofGastrointestinalandGlandSurgery,2DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:xiaoqiang20050@aliyun.com)

AIM: To evaluate the correlation between microRNA-1284 (miR-1284) and gastric cancer, and to investigate the underlying mechanism. METHODS: The expression of miR-1284 was examined by real-time PCR in 63 gastric cancer (GC) tissue samples and 63 non-malignant adjacent tissue samples. The correlation between miR-1284 and the clinicopathological feature of GC was analyzed. Lentiviral vector containing miR-1284 was constructed and transfected into GC SGC-7901 cells. After transfection, the expression of miR-1284 was examined by real-time PCR. The cell activity was evaluated by CCK-8 assay. The cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. The ability of cell migration was measured by wound-healing assay. The potential target gene of miR-1284 was predicted by online bioinformatic softwares. The expression of JAG1 mRNA was examined by real-time PCR. The protein levels of JAG1, Notch1 and NF-κB were analyzed by Western blotting. RESULTS: Compared with non-malignant adjacent tissue samples, the results of real-time PCR showed significant downregulation of miR-1284 in 42 GC tissue samples (P<0.05). The expression level of miR-1284 was not significantly associated with age and gender of the patients, tumor size, TNM staging and lymph node metastases (P>0.05), but significantly associated with histologic grading (P<0.05). Compared with LV-NC-GFP group and control group, after transfection of miR-1284 in LV-miR-1284 group, the expression of miR-1284 was significantly increased (P<0.05), the percentages of apoptotic cells and the cells in G0/G1phase were significantly increased (P<0.05), the cells activity and ability of migration were significantly decreased (P<0.05), and the expression of JAG1, Notch1 and NF-κB was significantly decreased (P<0.05). CONCLUSION: The inhibitory effect of miR-1284 on gastric cancer may be associated with the regulation of its targeting geneJAG1.

MicroRNA-1284; Stomach neoplasms; Lentiviral vectors; JAG1

1000- 4718(2015)03- 0440- 07

2014- 09- 12

2014- 12- 09

廣西科學技術(shù)攻關(guān)項目(No. 桂科攻14124004-1-9)

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R735.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.010