寧昕杰， 王 輝△， 陸新華， 羅駿成， 巴越洋

(1中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630； 2中山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 中山 520483)

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MicroRNA-21促進大鼠雪旺細胞增殖的實驗研究*

寧昕杰1， 王 輝1△， 陸新華1， 羅駿成1， 巴越洋2

(1中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630；2中山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 中山 520483)

目的： 探討神經(jīng)損傷后microRNA-21(miR-21)促進雪旺細胞增殖的分子機制。方法: 通過實時熒光定量PCR檢測miR-21的表達。通過脂質(zhì)體介導將人工合成的miR-21模擬物(mimic)及其陰性對照轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染miR-21的雪旺細胞的增殖。流式細胞術(shù)分析miR-21對雪旺細胞細胞周期的影響。使用Western blotting實驗分析轉(zhuǎn)化生長因子β誘導蛋白(TGFBI)和cyclin D1的表達水平。結(jié)果: miR-21在損傷模型組中的表達分別為假手術(shù)組和正常神經(jīng)組織的(7.87±0.75)和(7.75±0.80)倍(P<0.01)。miR-21 mimic組miR-21的表達分別為對照組和空白組的(2.21±0.14)和(2.29±0.21)倍(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后miR-21 mimic組CCK-8實驗的A450值較陰性對照組和空白對照組增高(P<0.05)。實驗組細胞增殖指數(shù)高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。同時與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-21后48 h實驗組細胞TGFBI明顯降低，cyclin D1表達增多(P<0.05)。結(jié)論: miR-21可促進雪旺細胞增殖，其機制可能與其下調(diào)TGFBI的表達有關(guān)。

微小RNA-21； 雪旺細胞； 周圍神經(jīng)損傷； 神經(jīng)再生

周圍神經(jīng)損傷后再生修復是神經(jīng)科學當前面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細胞(Schwann cells)作為周圍神經(jīng)再生的主體，發(fā)揮重要作用:(1)增殖并趨化巨噬細胞；(2)分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及細胞外基質(zhì)；(3)與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接[1]。這些行為在維持神經(jīng)元的存活，引導軸突再生，促進神經(jīng)損傷后再生修復中扮演重要角色。MicroRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控基因表達的關(guān)鍵因子，幾乎參與了包括生長、發(fā)育、衰老、疾病及死亡等所有的生物學過程[2]。研究表明，microRNA-21(miR-21)在周圍神經(jīng)損傷后高表達，是潛在的神經(jīng)損傷修復的治療靶點。但miR-21參與周圍神經(jīng)損傷后再生修復的機制尚不明確。因此，本文研究過表達miR-21對雪旺細胞增殖、細胞周期及細胞周期相關(guān)蛋白含量的影響，進一步探討miR-21在周圍神經(jīng)損傷后再生修復過程中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

24只重150 g實驗用SD大鼠由中山大學北校區(qū)動物實驗中心購得；RSC96雪旺細胞株購自中國科學院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(HyClone)；RNA 抽提試劑(TaKaRa)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；SYBR Green Real time PCR Mix (Roche)；CCK-8試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司)。miR-21類似物(mimic)及無意義序列(control miRNA)由Invitrogen合成。

2 主要方法

2.1 神經(jīng)損傷模型建立 將24只成年SD大鼠隨機分為神經(jīng)損傷組、假手術(shù)組和正常對照組。靜脈復合麻醉，左下肢做縱切口，逐層分離，暴露坐骨神經(jīng)上段，損傷模型組分離外膜后完全橫斷坐骨神經(jīng)后逐層縫合組織，假手術(shù)組逐層暴露坐骨神經(jīng)后縫合組織，正常對照組不做處理。

2.2 細胞培養(yǎng) RSC96細胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、 5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期RSC96 細胞于轉(zhuǎn)染前 24 h 接種于 6 孔板中，培養(yǎng)至細胞達 80% 融合度時進行細胞轉(zhuǎn)染，按照操作說明將miR-mimic和control miRNA轉(zhuǎn)染入RSC96細胞中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)后進行相關(guān)檢測。

2.4 RNA提取 分別將實驗組、陰性對照組及正常對照組組織剪碎，加入1 mL Trizol，冰上勻漿，轉(zhuǎn)入一新EP管中，室溫保存5 min，加氯仿0.2 mL，振蕩混合，室溫放置5 min，10 000 r/min 4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相(吸70%)到一新EP管中，加異丙醇0.5 mL，振蕩混合，室溫保存10 min，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，倒掉上清，加1 mL 75%無水乙醇(4 ℃保存)，振蕩混合，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，倒掉上清，室溫或37 ℃放置20 min，使RNA沉淀干燥。加20 μL DEPC水至EP管中，在60 ℃孵育3～5 min，使RNA充分溶解，測定RNA濃度。

2.5 熒光實時定量PCR PCR條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，采用U6作為內(nèi)參照，3次獨立樣本經(jīng)過3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)，通過比較 Ct值進行相對定量分析。miR-21和U6相應的逆轉(zhuǎn)錄引物[3]以及 PCR 引物見表1。

表1 MicroRNA-21及U6的引物序列

2.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖 收集上述各實驗組細胞制備成單細胞懸液，以每孔3000個接種于96孔培養(yǎng)板，每組細胞設5個平行孔，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24～96 h，每孔加入5 g/L的CCK-8 20 μL，繼續(xù)孵育2 h，酶標儀檢測 450 nm處各孔吸光度(A)值[4]。

2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞2次。加入預冷95%乙醇，于4 ℃固定過夜。離心收集細胞，以1 mL的PBS洗細胞1次，加入500 μL PBS(含50 mg/L溴化乙錠、100 mg/L RNase A和0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，計數(shù)3萬個細胞，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析，按照公式計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index, PI)，以衡量細胞的分裂活動，PI=(S+G2/M)/(Go/G1+S+G2/M)。

2.8 Western blotting檢測細胞中相關(guān)蛋白的表達 收集待檢測細胞，提取總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放在含5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入用TBST 1∶1 000稀釋的鼠抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子β誘導蛋白(transforming growth factor β-induced protein, TGFBI)單克隆抗體和鼠抗鼠cyclin D1單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次，用辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG抗體，在室溫下孵育1 h將膜洗滌后，用ECL加蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)分析(Amersham)，以β-actin作為內(nèi)參照[5]。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗重復3次，運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間數(shù)據(jù)的差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 RNA抽提

以相應溶劑為空白對照，取2 μL RNA溶液于紫外分光光度計檢測，觀察A260/A280及連續(xù)波長吸收峰，并計算 RNA 溶液濃度，正常外周神經(jīng)組織和 RSC96細胞系總RNA 的A260/A280介于 2.0～2.3，表明RNA提取的質(zhì)量可以滿足后續(xù)real-time PCR 所需[6]。

2 miR-21 在損傷模型組神經(jīng)組織中的表達

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：miR-21在損傷模型組中的表達，分別為假手術(shù)組和正常神經(jīng)組織的(7.87±0.75)倍和(7.75±0.80)倍，明顯高于假手術(shù)組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.miR-21 expression was higher in injury group than that in control groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs other 2 groups.

轉(zhuǎn)染miR-21mimic和control miRNA入RSC96細胞系，使用real-time PCR檢測miR-21的表達情況，結(jié)果顯示miR-21 mimic組miR-21的表達分別為對照組和空白組的(2.21±0．14)倍和(2.29±0.21)倍，明顯高于其它2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.Change of miR-21 expression after transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs other 2 groups.

3 miR-21 對雪旺細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的雪旺細胞48 h后，實驗組A450值與陰性對照組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的雪旺細胞96 h后，實驗組A450值與轉(zhuǎn)染對照組和正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of miR-21 on Schwann cell proliferation. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs other 2 groups.

4 miR-21對雪旺細胞細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測細胞周期的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic實驗組細胞增殖指數(shù)高于陰性對照組和空白對照組，見圖4。

5 miR-21對TGFBI和cyclin D1蛋白表達水平的影響

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，miR-21 mimic組細胞中TGFBI蛋白表達水平明顯低于其它2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而實驗組內(nèi)細胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1表達高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect of miR-21 transfection on the cell cycle of Schwann cells detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs other 2 groups.

Figure 5.TGFBI and cyclin D1 protein levels in Schwann cells after transfection of miR-21 mimic detected by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs other 2 groups.

討 論

周圍神經(jīng)損傷是我國多發(fā)性疾病之一，每年因外傷、醫(yī)療損傷等導致的神經(jīng)損傷約100萬人，神經(jīng)功能缺失嚴重影響著患者的生存質(zhì)量。目前在臨床上主要有自體神經(jīng)移植、人工合成神經(jīng)等治療手段，盡管可以部分恢復受損神經(jīng)功能，但是都未能取得令人滿意的結(jié)果。在神經(jīng)再生修復的過程中，雪旺細胞的增殖能力、存活數(shù)量、凋亡比例是周圍神經(jīng)再生的決定性因素。然而，多數(shù)情況下，受損部位雪旺細胞的增殖分化與細胞數(shù)量無法支持受損神經(jīng)完成再生，結(jié)果形成疤痕。因而尋找調(diào)控雪旺細胞增殖的新機制成為周圍神經(jīng)修復再生領域研究的重要問題[7]。

近年來的研究表明，miRNAs在受損神經(jīng)的雪旺細胞中表達異常，導致多個基因的表達變化，從而調(diào)控雪旺細胞的分化、分泌等生物學行為[8]。Yu等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷后，大鼠神經(jīng)組織中miR-21、miR-221等miRNAs表達特異性升高；Strickland等[11]實驗證實過表達miRNA-21具有調(diào)控大鼠背根神經(jīng)元促軸突再生的作用。在本研究中，我們用人工合成的miR-21寡聚核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞RSC96，旨在揭示miR-21對雪旺細胞的生物學作用。經(jīng)CCK-8方法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-21實驗組在轉(zhuǎn)染后48和96 h的細胞增殖較其它各對照組均有顯著上升，說明雪旺細胞的增殖活力受到miR-21的影響而提高。同時流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，miR-21實驗組的細胞周期分布在轉(zhuǎn)染后48 h發(fā)生改變，處于S期和G2/M期的細胞比例增多，細胞增殖指數(shù)增多，說明miR-21的轉(zhuǎn)染引起了雪旺細胞的細胞周期變化。由此可以得出，miR-21參與雪旺細胞的增殖和細胞周期調(diào)控。

TGFBI是由Skonier等[12]于1992年從人肺腺癌細胞系A549中發(fā)現(xiàn)的細胞外基質(zhì)蛋白，是miR-21潛在的靶基因之一，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，與細胞的損傷修復、形態(tài)形成密切相關(guān)。細胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1是目前公認的調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵因子，正性調(diào)控細胞周期G1/S關(guān)卡。已有的研究表明，cyclin D1基因的表達受到TGFBI的調(diào)控[13]。并通過傳導生長因子信號刺激可引起下游一系列級聯(lián)調(diào)控，從而促進細胞周期的進程。本實驗通過對Western blotting灰度值分析后，顯示TGFBI在miR-21實驗組中表達低于對照組，cyclin D1蛋白在miR-21實驗組中表達明顯高于對照組。這提示miR-21靶定TGFBI并調(diào)控cyclin D1表達，加速細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進雪旺細胞增殖[14]。

雪旺細胞是周圍神經(jīng)損傷修復的重要支持細胞，缺乏足夠的雪旺細胞是制約神經(jīng)再生修復的關(guān)鍵問題。本研究證實，神經(jīng)損傷后miR-21在雪旺細胞中高表達，并通過靶基因TGFBI介導cyclin D1的表達，調(diào)控雪旺細胞增殖生長，揭示了神經(jīng)損傷后雪旺細胞增殖的新機制，為治療周圍神經(jīng)損傷提供新的思路。

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MicroPNA-21 promotes proliferation of rat Schwann cells following nerve injury

NING Xin-jie1, WANG Hui1, LU Xin-hua1, LUO Jun-cheng1, BA Yue-yang2

(1DepartmentofNeurosurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofNeurosurgery,ZhongshanPeople’sHospital,Zhongshan520483,China.E-mail:doctorwanghui@126.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of microRNA-21 (miR-21) in the regulation of Schwann cell proliferation following nerve injury. METHODS: The expression of miR-2l was detected by real-time PCR. Synthetic miR-21 mimic and its control were transfected into rat Schwann cells. CCK-8 assay was performed to evaluate the influence of miR-21 on the proliferation of Schwann cells. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry. The expression of transforming growth factor β-induced protein (TGFBI) and cyclin D1 were detected by Western blotting. RESULTS: The expression of miR-21 in model group was 7.87±0.75 and 7.75±0.80 times higher than that in sham operation group and blank group respectively. After transfected with miR-21 mimic, the expression of miR-21 in experimental group was 2.21±0.14 and 2.29±0.21 times higher than that in negative control group and blank group respectively. Moreover, theA450value of CCK-8 assay in experimental group at 48 h was higher than that in negative control group and blank group. The proliferation index in experimental group was higher than that in negative control group and blank group. At the same time, the expression of TGFBI obviously decreased and the cyclin D1 increased in the Schwann cells 48 h after transfection with miR-21. CONCLUSION: miR-21 promotes the proliferation activity of Schwann cells by down-regulating TGFBI expression．

MicroRNA-21; Schwann cells; Peripheral nerve injury; Nerve regeneration

1000- 4718(2015)03- 0392- 05

2014- 10- 22

2014- 12- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 30901542)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 7301217)；廣東省醫(yī)學科學基金資助項目(No. B2007061)；廣東省科技計劃(No. 2012B031800056)；中山大學高?；緲I(yè)務費青年教師培育資助項目(No. 12ykpy44)

△通訊作者 Tel： 020-85252170； E-mail： doctorwanghui@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.002