陳 薇，郭愛桃，李亞卓，孫 璐

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院病理科，海南 三亞 572013)

高壓抗原修復(fù)液的pH值對(duì)淋巴組織免疫組化染色的影響

陳 薇，郭愛桃，李亞卓，孫 璐

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院病理科，海南 三亞 572013)

目的 研究高壓抗原修復(fù)液的pH值對(duì)淋巴組織免疫組化染色的影響。方法運(yùn)用高壓的抗原修復(fù)方式，按修復(fù)液pH值的不同分為pH 6.0枸櫞酸抗原修復(fù)組和pH8.0EDTA抗原修復(fù)組，對(duì)76例淋巴組織進(jìn)行免疫組化染色，每例分別標(biāo)記抗體CD3、CD20和CD5。結(jié)果pH 6.0枸櫞酸抗原修復(fù)組有9例陽性標(biāo)記不明確，其中5例出現(xiàn)了細(xì)胞膜破損，67例符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；pH8.0EDTA抗原修復(fù)組有60例陽性標(biāo)記不明確，其中59例出現(xiàn)了細(xì)胞膜破損，僅有16例組織染色符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論免疫組化染色中，使用pH 8.0 EDTA抗原修復(fù)液對(duì)淋巴組織進(jìn)行高壓修復(fù)，致使淋巴細(xì)胞胞膜破損，使用pH 6.0枸櫞酸高壓修復(fù)有助于避免這一現(xiàn)象。

淋巴組織；免疫組化染色；抗原修復(fù)液；EDTA；枸櫞酸

免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC；以下簡(jiǎn)稱免疫組化)染色技術(shù)是在組織化學(xué)方法上結(jié)合免疫學(xué)的理論發(fā)展起來的一門技術(shù)，近年來隨著染色技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高，免疫組化已經(jīng)被越來越廣泛地應(yīng)用于病理常規(guī)工作中，成為病理診斷不可或缺的檢測(cè)技術(shù)和手段，為輔助疾病診斷、判斷預(yù)后，以及檢測(cè)腫瘤組織的相關(guān)抗原，指導(dǎo)臨床治療提供了重要依據(jù)[1]。但是免疫組化染色是一種多步驟、多因素決定的實(shí)驗(yàn)方法，存在很多干擾因素，標(biāo)本的固定、脫水、實(shí)驗(yàn)室操作條件以及操作人員素質(zhì)等的不同都可導(dǎo)致結(jié)果的差異，甚至有時(shí)會(huì)因?yàn)椴煌貐^(qū)的溫度、濕度以及水質(zhì)的差異而影響染色結(jié)果，出現(xiàn)不理想的染色，從而影響醫(yī)生的病理診斷，嚴(yán)重者可能會(huì)造成誤判和誤診。在眾多影響因素中，抗原修復(fù)方式是影響免疫組化染色結(jié)果的最主要因素之一[2]。中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院(以下簡(jiǎn)稱海南分院)開診近兩年來，在免疫組化染色中出現(xiàn)了一些異?，F(xiàn)象，其中比較集中的問題體現(xiàn)在淋巴細(xì)胞出現(xiàn)難以解釋的胞漿腫脹和胞膜彌散現(xiàn)象，從而導(dǎo)致陽性標(biāo)記不明確，染色效果不理想，給病理醫(yī)生判斷免疫組化結(jié)果帶來了很大困難，經(jīng)調(diào)整高壓修復(fù)時(shí)間和3%H2O2的孵育時(shí)間，效果均不明顯。本文針對(duì)這一問題通過調(diào)整高壓修復(fù)液的pH值進(jìn)行對(duì)比研究，探討高壓修復(fù)液的pH值與免疫組化染色切片中淋巴細(xì)胞胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散現(xiàn)象之間的關(guān)系，為以后的免疫組化染色工作以及病理醫(yī)生對(duì)于免疫組化切片的觀察和結(jié)果判讀提供可靠的理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 復(fù)查中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院病理科2012年7月至2014年7月期間所有曾進(jìn)行免疫組化染色的病例，選擇其中富于淋巴細(xì)胞且為非穿刺活檢組織者作為研究對(duì)象，共76例。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 采用配對(duì)實(shí)驗(yàn)，分為EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)(pH 8.0)緩沖液抗原修復(fù)組和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液液抗原修復(fù)組兩組。

1.3抗體及試劑 標(biāo)記抗體有CD3、CD5和CD20，所用一抗均使用安必平公司即用型工作液，二抗使用安必平LBP-VBrightI通用型二抗聚合物檢測(cè)試劑盒。

1.4 方法 挑選的組織塊均行3 μm連續(xù)切片，每例6張，EDTA(pH 8.0)緩沖液抗原修復(fù)組和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液抗原修復(fù)組各3張，分別在切片上進(jìn)行修復(fù)液和標(biāo)記抗體的標(biāo)識(shí)。所有切片均統(tǒng)一進(jìn)行70℃烤片機(jī)烤片1 h，常規(guī)脫蠟及水化。水化后EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)組切片放入EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液高壓修復(fù)1.5 min；枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復(fù)組切片放入枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液中高壓修復(fù)2.5 min。兩組切片均同時(shí)進(jìn)行免疫組化標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素返藍(lán)，以細(xì)胞膜的棕黃色著色為陽性反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩組的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

76例經(jīng)EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)的切片中有60例染色效果欠佳，陽性標(biāo)記不明確，影響了醫(yī)生對(duì)結(jié)果的判讀，其中59例均出現(xiàn)了細(xì)胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散現(xiàn)象，僅有16例組織符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；而枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液修復(fù)組中有9例陽性標(biāo)記不明確，其中5例出現(xiàn)了細(xì)胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散現(xiàn)象(圖1~圖6)，67例符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)無論在陽性標(biāo)記明確與否的比例上，還是細(xì)胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散現(xiàn)象的發(fā)生率上，兩組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1兩種pH值的抗原修復(fù)液修復(fù)后的免疫組化染色切片比較[例(%)]

圖1 CD3抗體標(biāo)記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性；圖2 CD3抗體標(biāo)記，EDTA(pH 8.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性彌散；圖3 CD5抗體標(biāo)記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性；圖4 CD5抗體標(biāo)記，EDTA(pH 8.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性彌散；圖5 CD20抗體標(biāo)記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性；圖6 CD20抗體標(biāo)記，EDTA(pH 8.0)高壓修復(fù)，細(xì)胞膜陽性彌散。

3 討 論

在臨床病理診斷中，免疫組化染色已經(jīng)成為一種不可或缺的檢測(cè)手段，尤其對(duì)腫瘤組織的起源、分類和鑒別都發(fā)揮了重要的作用。免疫組化染色切片的質(zhì)量直接影響著病理醫(yī)生對(duì)于染色結(jié)果的判讀，因此良好的免疫組化染色是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。然而免疫組化染色過程中的每一個(gè)操作環(huán)節(jié)都有可能對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生影響，如：組織取材、固定、切片；抗原修復(fù)方式、修復(fù)溫度、修復(fù)時(shí)間以及修復(fù)液的pH值；還包括各種液體的配制、DAB顯色等等；有時(shí)甚至?xí)驗(yàn)椴煌貐^(qū)的溫度、濕度以及水質(zhì)不同而產(chǎn)生染色差異，因此摸索出適合自己實(shí)驗(yàn)室的最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)于穩(wěn)定免疫組化染色的質(zhì)量至關(guān)重要。

組織標(biāo)本因?yàn)樵谑褂酶栺R林固定后蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，造成抗原被遮蔽，因此需要通過抗原修復(fù)打開醛基，使抗原決定簇暴露，從而使特異性抗體與之結(jié)合[3]。在多種影響免疫組化染色結(jié)果的因素中抗原修復(fù)被認(rèn)為是最重要的影響因素之一。不同的抗原修復(fù)對(duì)于裂解醛-氨基之間交聯(lián)或蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)的能力不同，從而使抗原決定簇暴露的程度不同；此外不同抗原對(duì)于不同抗原修復(fù)方式的敏感性不同，也造成了標(biāo)記效果不同；甚至相同的抗體不同克隆號(hào)在不同的抗原修復(fù)方式下與抗原的結(jié)合能力也有所不同。因此，一種抗原修復(fù)方法不可能同時(shí)適用于所有抗原的修復(fù),選用最佳的抗原修復(fù)方法尤為重要。最佳的抗原修復(fù)方式應(yīng)在暴露抗原決定簇的效果達(dá)到最好的情況下，同時(shí)還不會(huì)對(duì)原有的細(xì)胞形態(tài)造成影響，在對(duì)原有的細(xì)胞形態(tài)造成影響的情況下，即使是被公認(rèn)為最好的抗原修復(fù)方式在實(shí)際工作中應(yīng)用價(jià)值也不大。

目前使用較多的抗原修復(fù)液有EDTA修復(fù)液和枸櫞酸修復(fù)液。枸櫞酸修復(fù)液pH值為6.0，適合于中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，在高壓條件下，其修復(fù)效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法，結(jié)果較為穩(wěn)定，但與EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液相比，對(duì)于某些抗體其修復(fù)效果相對(duì)較弱。早在1995年Shi等[4]就報(bào)道了不同pH值抗原修復(fù)對(duì)免疫組化的影響，并且認(rèn)為高pH值的高溫抗原修復(fù)對(duì)于大多數(shù)的核抗體和胞漿抗體都能取得不錯(cuò)的效果，因此，高pH值高壓修復(fù)方式，以其時(shí)間短、抗原修復(fù)效果好和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于大多數(shù)抗原的修復(fù)當(dāng)中。但有文獻(xiàn)報(bào)道EDTA對(duì)組織形態(tài)及完整性有一定的破壞作用，加之高壓的修復(fù)方式，組織形態(tài)破壞較為明顯[5-6]，一直未引起同行的重視。

在海南分院病理科免疫組化實(shí)驗(yàn)室條件下，參照所購(gòu)抗體說明并進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗原使用EDTA(pH 8.0)高壓熱修復(fù)后，可以取得良好的染色效果。但對(duì)于富于淋巴細(xì)胞的組織，使用EDTA (pH 8.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓熱修復(fù)后出現(xiàn)了細(xì)胞膜破損情況，主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散，細(xì)胞界限模糊不清，使陽性標(biāo)記效果不明確，結(jié)果判斷困難。經(jīng)反復(fù)多次并多梯隊(duì)調(diào)整高壓修復(fù)時(shí)間和3% H2O2的孵育時(shí)間后效果均不明顯。本實(shí)驗(yàn)采用配對(duì)實(shí)驗(yàn)，在其他試驗(yàn)條件均相同的情況下對(duì)EDTA(pH 8.0)緩沖液和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液兩種不同pH值的抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)后染色效果的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間無論在陽性標(biāo)記明確與否的比例上，還是細(xì)胞漿腫脹和細(xì)胞膜彌散現(xiàn)象的發(fā)生率上，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000)，采用枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)后染色，此種現(xiàn)象基本消失，因此我們認(rèn)為EDTA對(duì)于淋巴細(xì)胞的形態(tài)具有一定程度的破壞性，導(dǎo)致細(xì)胞漿腫脹、細(xì)胞膜彌散，影響了抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)影響了病理醫(yī)生對(duì)于免疫組化切片中組織形態(tài)的觀察。

有文獻(xiàn)指出在EDTA修復(fù)液中加入EDTA-2Na可降低EDTA的電離度,達(dá)到減輕對(duì)組織破壞的作用[5]，但操作較為繁瑣；另有文獻(xiàn)建議使用高pH值水煮的修復(fù)方式代替高壓修復(fù)，但此法相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)，常規(guī)工作中的應(yīng)用受到了一定程度的限制。因此，在科室工作量、工作模式和免疫組化實(shí)驗(yàn)室不變的條件下，對(duì)富于淋巴細(xì)胞的組織進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，為保護(hù)細(xì)胞形態(tài)的完整性，避免影響染色效果，除了對(duì)修復(fù)條件有特殊要求的抗體外，在采用高溫高壓抗原修復(fù)方式時(shí)，建議使用枸櫞酸(pH 6.0)修復(fù)液來替代EDTA(pH 8.0)修復(fù)液[7]。

[1]周小鴿.免疫組織化學(xué)染色的干擾因素及其處理[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(4)：389-392.

[2]駱新蘭,林興滔,羅東蘭,等.pH 9.0不同成分的抗原修復(fù)液對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的影響[J].中華病理學(xué)雜志,2012,41(3)：192-194.

[3]郭 麗,祁 榮,吳 鵬.不同的抗原修復(fù)方法在免疫組化染色中的應(yīng)用[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,14(3)：152-153.

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[6]范 慧,張 緊,杜德利,等.抗原修復(fù)液pH對(duì)免疫組化的影響[J].山東醫(yī)藥,2001,12：72-73.

[7]丁 偉,王德田.簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2014,1：143-149.

Effects of different pH values of high-pressure antigen retrieval buffers on immunohistochemical staining of lymphoid tissue.

CHEN Wei,GUO Ai-tao,LI Ya-zhuo,SUN Lu.Department of Pathology,Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital,Sanya 572013,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the influence of pH values of high-pressure antigen retrieval buffers on immunohistochemical staining of lymphoid tissue.MethodsSeventy-six cases of lymphoid tissue were divided into two groups,which were treated with pH 6.0 citrate buffer(pH 6.0 citrate buffer group)and pH 8.0 EDTA buffer(pH 8.0 EDTA group)by high-pressure repairing.Each cases was stained by antibody CD3,CD5,CD20.ResultsIn the pH 6.0 citrate buffer group,9 cases showed unclear positive markers(including 5 cases of lymphotye injury),and 67 cases reached the diagnostic criteria.Of the pH 8.0 EDTA group,60 cases showed unclear positive marker(including 59 cases of lymphocyte injury),and 16 cases reached the diagnostic criteria.The difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).ConclusionUsing pH 8.0 EDTA buffer for high-pressure repairing in immunohistochemical staining often leads to lymphoctye injury,but pH 6.0 citrate buffer could avoid this problem.

Lymphoid tissue;Immunohistochemical staining;Antigen retrieval buffer;EDTA;Citrate

R446.6

A

1003—6350（2015）09—1370—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0492

2014-11-24)

陳 薇。E-mail：chenweiw12@126.com