夏卉芳

（1.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2.貴州特色生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550018）

胎鼠肢芽軟骨染色技術(shù)的一點(diǎn)改進(jìn)

夏卉芳1，2

（1.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2.貴州特色生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550018）

目的 改進(jìn)阿利新藍(lán)單染胎鼠肢芽軟骨技術(shù)，尤其是改進(jìn)后的技術(shù)免用對(duì)人體有毒或致癌的試劑。方法將SPF級(jí)SD大鼠13～16 d齡的胚鼠前或后肢芽用阿利新藍(lán)染液染色、丙三醇透明，最后將透明好的肢芽標(biāo)本用DPX樹脂鑲嵌在載玻片上待觀測(cè)。結(jié)果胎鼠前肢芽各部分發(fā)育分化的軟骨均被染成藍(lán)色，標(biāo)本完全符合在體視顯微鏡下對(duì)肢芽軟骨是否畸形的觀測(cè)及前肢芽軟骨半定量Neubert 300分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論阿利新藍(lán)單染胎鼠肢芽軟骨技術(shù)經(jīng)改進(jìn)后，肢芽軟骨染色好，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)化、時(shí)間縮短、節(jié)約成本、安全環(huán)保。

胚胎；肢芽；軟骨染色；阿利新藍(lán)

在致畸實(shí)驗(yàn)中，胎鼠骨骼的畸形檢測(cè)是必須的，而對(duì)胎鼠骨骼進(jìn)行染色評(píng)測(cè)是首選的檢測(cè)胎鼠骨骼畸形的方法[1-9]。目前國內(nèi)、外常用的胎鼠骨骼染色方法有阿利新藍(lán)單染法或阿利新藍(lán)-茜素紅雙染法，其中阿利新藍(lán)單染法常用于染胎鼠的軟骨，雙染法用于染胎鼠的軟骨和骨。阿利新藍(lán)單染胎鼠軟骨技術(shù)應(yīng)用于各種因素導(dǎo)致的胚胎骨骼畸形研究和胚胎骨骼形態(tài)發(fā)育的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域[10-13]。

依據(jù)胎鼠肢芽軟骨染色技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)及多次試驗(yàn)，現(xiàn)改進(jìn)成一種專用于染鼠胚胎肢芽軟骨的簡(jiǎn)易染色技術(shù)方法，此方法與原來的方法相比的優(yōu)點(diǎn)在于：染好色的標(biāo)本更加透明容易觀測(cè)，染色時(shí)間大大縮短至原來時(shí)間的1/4，經(jīng)過簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)程序使得幾種易爆有毒或致癌化學(xué)藥品去除，如二甲苯、Bouin's液(含福爾馬林、苦味酸)及含氨水的乙醇等[14-21]?，F(xiàn)將胎鼠肢芽軟骨染色技術(shù)改進(jìn)方法介紹如下：

1 材料與方法

1.1 染色液的配制 阿利新藍(lán)染液：先量取70%乙醇950 ml，再稱取阿利新藍(lán)干粉90 mg，最后用冰醋酸定容至1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 染色對(duì)象 SPF級(jí)SD大鼠14～16 d齡胚鼠的前或后肢芽(也可用SPF級(jí)昆明種小白鼠13～16 d齡的胚鼠前或后肢芽)。

1.2.2 染色步驟 (1)清洗肢芽：首先將上述肢芽放入培養(yǎng)皿中用pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，再用70%乙醇清洗肢芽三遍，6遍合計(jì)清洗1 h。(2)染色：將清洗好的肢芽轉(zhuǎn)入規(guī)格為50×30稱量瓶中用阿利新藍(lán)染液染色24 h。(3)脫水：將染好色的肢芽:分別用70%、80%、95%梯度乙醇各脫水10 min。(4)透明：將染好色的肢芽轉(zhuǎn)入純丙三醇中透明2 h[20]。(5)制片：最后將透明好的肢芽標(biāo)本用DPX樹脂鑲嵌在載玻片上待測(cè)。

2 結(jié)果

使用改進(jìn)染色方法染色的胎鼠前肢芽各部分發(fā)育分化的軟骨均被染成藍(lán)色，且各軟骨形態(tài)清晰可見且界限非常明確，皮膚及其他組織呈現(xiàn)透明無色。用改進(jìn)胎鼠軟骨染色技術(shù)染色的標(biāo)本完全符合體視顯微鏡下對(duì)肢芽軟骨是否畸形的觀測(cè)及前肢芽軟骨半定量Neubert 300分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 E14前肢芽(阿利新藍(lán)染色，×10倍);圖2 E15前肢芽(阿利新藍(lán)染色且樹脂鑲嵌，×10倍)

3 討論

在致畸實(shí)驗(yàn)中，胎鼠骨骼染色技術(shù)是直接關(guān)系到骨骼畸形的判斷，如果染色不夠清晰，?？杀徽`認(rèn)為某個(gè)骨骼的缺失或骨發(fā)育延遲。尤其是對(duì)及其細(xì)小柔軟的鼠胚胎肢芽軟骨進(jìn)行染色，一定要對(duì)標(biāo)本的各個(gè)部位：肩胛骨、肱骨、尺骨、橈骨、腕骨和第1～5掌指骨都要染到位。

3.1 鼠肢芽軟骨染色改進(jìn)前的缺點(diǎn) 既往對(duì)鼠肢芽軟骨染色經(jīng)歷的程序：PBS沖洗、Bouin's液固定過夜、含0.05%氨水的70%乙醇脫色2 h以上(經(jīng)常脫色不全，造成下一步的阿利新藍(lán)染液染色分界不清)、阿利新藍(lán)染液染色48 h、脫色液(無水乙醇:冰醋酸=3:1)脫色2 d、70%乙醇清洗1 h、95%乙醇脫水4 h、二甲苯透明2～6 h、70%乙醇清洗1 h、松木油保存。其程序繁瑣、染色時(shí)間長(zhǎng)，尤其重要的是還要用到對(duì)人體有一定毒性或強(qiáng)烈致癌的化學(xué)藥Bouin's液(Bouin's液=苦味酸飽和液15份：福爾馬林5份：冰醋酸1份)固定、含0.05%氨水的70%乙醇脫色多次、二甲苯透明及其松木油保存。此法染色特點(diǎn)是時(shí)間所用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)109 h以上、要用到有害健康和環(huán)境及危險(xiǎn)藥品。其中所用的試劑藥品福爾馬林具有強(qiáng)烈致癌作用；苦味酸屬于可產(chǎn)生紅血球損傷、腎炎、昏迷等人體危害易爆危險(xiǎn)化學(xué)藥品；氨水是對(duì)呼吸道和皮膚有刺激作用并能損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成對(duì)人身體健康危害的低毒類化學(xué)藥品；松木油的價(jià)格非常昂貴。

3.2 鼠肢芽軟骨染色改進(jìn)后的優(yōu)點(diǎn) 改進(jìn)完善后的胎鼠肢芽軟骨染色技術(shù)方法不僅染色程序簡(jiǎn)單、染色時(shí)間短、安全無毒，而且染色效果好。染色時(shí)間僅僅為27 h，大概為原來時(shí)間染色時(shí)間的1/4。由原來10個(gè)步驟109 h左右簡(jiǎn)略到現(xiàn)在4個(gè)步驟27 h。安全無害：改進(jìn)后的染色技術(shù)中減掉3種有害健康化學(xué)試劑：分別為、福爾馬林、苦味酸、氨水。染色中使用的材料非常簡(jiǎn)單廉價(jià)：價(jià)格非常昂貴的松木油用低廉的丙三醇替代。從而大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本及胎鼠肢芽軟骨的染色時(shí)間、更加重要的是整個(gè)染骨過程中無須用到有毒有害的化學(xué)藥品，保證了科研人員的身體健康安全。

綜上所述，改進(jìn)后的肢芽染色技術(shù)不但有利于科研人員身體健康、生命安全，縮短實(shí)驗(yàn)周期、改善環(huán)境，而且具有技術(shù)路線成熟可靠、染色效果清晰、染色與非染色區(qū)分界明顯、實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確等優(yōu)點(diǎn)。改進(jìn)后的肢芽染色技術(shù)同時(shí)兼有實(shí)驗(yàn)效果好、省時(shí)、省錢、步驟簡(jiǎn)單、生命安全性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種可靠并值得推廣的新技術(shù)方法。

[1]夏卉芳,王 毓.應(yīng)用骨骼染色評(píng)價(jià)胎鼠骨發(fā)育的3種方法[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,6(29):788-880.

[2]李 勇,王維林,袁正偉,等.一種簡(jiǎn)捷可靠的胎鼠骨和軟骨雙重染色技術(shù)[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,2(33):189-190.

[3]李 勇,張?zhí)鞂?發(fā)育毒理學(xué)研究方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社,2000:84-89.

[4]許立芹,王 東,蔡 恒,等.隔致胎鼠骨骼發(fā)育異常的形態(tài)學(xué)觀察[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,1(31):11-15.

[5]李梓民,何愛桃,吳成秋,等.苯致小鼠胚胎肢芽發(fā)育毒作用[J].中國公共衛(wèi)生,2008,24(4):458-459.

[6]涂國平,羅 潔,李 云.金雀異黃素對(duì)體外小鼠肢芽軟骨發(fā)育的影響[J].衛(wèi)生研究,2002,31(4):304-305.

[7]張 勇,李 云,曾令福.鋅與金雀異黃素對(duì)小鼠胚胎肢芽的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,34(1):1-4.

[8]李梓民,何愛桃,吳成秋,等.苯對(duì)體外培養(yǎng)小鼠肢芽軟骨發(fā)育的毒性研究[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2007,35(2):158-160.

[9]Nakane Y.Development of the skeleton on Japanese quail embryos [J].Dev Growth Differ,1999,41(5):523-524.

[10]Menegola E,Broccia ML,Giavini E.Atlas of rat fetal skeleton double stained for bone and cartilage[J].Teratology,2001,64(3): 125-133.

[11]Young AD,Phipps DE,Astroff AB.Large scale double staining of rat fetal skeletons using Alizarin Red and Alcian Blue[J].Teratology,2000,61(4):273-276.

[12]張桂林,譚炳海,商好敏,等.小鼠軟骨發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(5):54-56.

[13]元 瑛,張本忠.應(yīng)用小鼠胚胎肢芽培養(yǎng)方法評(píng)價(jià)氟的致畸性及其對(duì)肢芽軟骨細(xì)胞膠原合成的影響[J].甘肅科技縱橫,2008,37 (4):188-189.

[14]楊小龍,王志超,何頂正,等.胎兒骨骼染色透明標(biāo)本的設(shè)計(jì)與制造[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,29(2):91-96.

[15]陳 彬,王躍招.介紹一種透明骨骼標(biāo)本染色法[J].生物學(xué)通報(bào), 2002,37(4):57.

[16]袁群芳,謝 瑤,趙 爽,等.對(duì)比制作乳鼠骨骼染色透明標(biāo)本體會(huì)[J].解剖學(xué)研究,2009,5(31):387-389.

[17]于勝波,張成鴻,唐 煒,等.陳舊動(dòng)物胚胎骨骼透明染色方法[J].中國臨床解剖學(xué)雜志,2009,4(27):5-6.

[18]高秉琴,陳彥文.特殊骨標(biāo)本制作方法的研究與改進(jìn)[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,3(18):15-17.

[19]洪 虹,張本斯,唐洗敏,等.甘油制作胚胎骨骼染色透明標(biāo)本的體會(huì)[J].局部手術(shù)學(xué)雜志,2007,3(16):191.

[20]郭連軍,劉文慶,鄭 輝.胚胎骨骼染色透明標(biāo)本的制作[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,3(24):342-343.

[21]鐘永盛,賈艷麗,陳 斌,等.先天性馬蹄內(nèi)翻足動(dòng)物模型胚胎后肢(芽)評(píng)分系統(tǒng)的建立[J].中華小兒外科雜志,2009,6(30): 397-400.

Some improvements to the staining of limb bud cartilage in fetal mouse.

XIA Hui-fang1,2.
1.Guizhou Normal College,Guiyang 550018,Guizhou,CHINA;2.Key Laboratory of Guizhou Characteristics Biological Resources Development and Utilization,Guiyang 550018,Guizhou,CHINA

Objective To improve the simple Alcian blue staining of limb bud cartilage in fetal mouse using no toxic or carcinogenic reagents.MethodsThe forelimb buds or hindlimb buds of SPF SD rats(13～16 days old)were stained by Alcian blueand then immersed in glycerol.The transparent specimens were placed onto the slide by DPX resin for observation.ResultsAll differential cartilage of forelimb buds were dyed blue.And all the specimens met the criteria of deformity observations under stereo microscope and the semi-quantitative Neubert 300 evaluation criteria of the forelimb buds cartilage.ConclusionThe improved Alcian blue simple staining technique could help enhance staining effect, simplify experimental procedure,shorten staining time and cut cost,and it was safe and environmental-friendly.

Embryo;Limb bud;Cartilage staining;Alcian blue

R-332

A

1003—6350（2015）06—0785—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0282

2014-09-30)

教育部生物資源科學(xué)專業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：2012287)；貴州省重點(diǎn)支持學(xué)科建設(shè)(編號(hào)：2011231)；貴州省應(yīng)用化學(xué)特色重點(diǎn)學(xué)科[編號(hào)：黔教科研發(fā)(2012)442號(hào)]

夏卉芳。E-mail：xiahuifanggy@163.com