李海霞，李曉梅，陳邦黨，劉芬，楊毅寧，蓋敏濤，陳小翠，馬依彤

(1.山東省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南250000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心冠一科，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011)

·論著·

S1P信號通路在肥厚心肌缺血后適應(yīng)中的作用

李海霞1，2，李曉梅2，陳邦黨3，劉芬3，楊毅寧3，蓋敏濤3，陳小翠3，馬依彤2

(1.山東省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南250000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心冠一科，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011)

目的探討在缺血后適應(yīng)(IPost)減輕肥厚心肌缺血再灌注(IR)損傷中S1P信號通路的作用。方法選取12周齡C57/BL小鼠，利用Langendorff灌流裝置建立小鼠肥厚心肌IR模型，30 min全心缺血隨后再灌注90 min。64只小鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組(IR組)、缺血后適應(yīng)組(IPost組)、IPost+W-146組和IPost+ PD98059組，每組14只，進(jìn)行心臟血流動(dòng)力學(xué)和心肌梗死范圍檢測，Western印跡方法檢測S1P1、ERK1/2總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果與IR組比較，IPost組小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左心室收縮壓[(66±6)mmHg vs(85±5)mmHg]、左室壓力上升最大速度[(2 820±220)mmHg vs(3 778±230)mmHg]顯著降低(P＜0.05)，心肌梗死范圍顯著減小[(23.6±2.8)%vs (40.2±4.6)%]。IPost+抑制劑組顯示在再灌注的最初15 min使用W-146、PD98059能消除IPost對肥厚心肌的上述保護(hù)作用并顯著增加心肌梗死面積，與IR組水平相同。與IR組比較，IPost組在再灌注結(jié)束后心肌組織中的S1P1、ERK1/2蛋白磷酸化水平表達(dá)顯著增加；IPost+W-146組與IPost+PD98059組分別與IR組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；TUNEL法檢測結(jié)果顯示，IPost組Bcl-2的表達(dá)較其他各組明顯升高，Bax的表達(dá)較其他各組明顯降低，經(jīng)比較各組之間Bcl-2和Bax的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論IPost能有效地減輕離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷，IPost的心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能是通過S1P結(jié)合S1P1后激活ERK1/2信號通路實(shí)現(xiàn)的。

S1P；S1P1；肥厚心??；缺血再灌注；缺血后適應(yīng)

缺血后適應(yīng)(Ischemic postconditioning，IPost)能夠有效的減輕急性心肌梗死患者的再灌注損傷，是目前的研究熱點(diǎn)，尤其是探討S1P信號通路在IPost減輕肥厚心肌缺血再灌注(IR)損傷中的作用，一些學(xué)者紛紛著手該方面的研究，但均遇到一些瓶頸問題。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，是重要的信號分子，在心血管系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用，越來越受到人們的重視[1]，S1P是否參與肥厚心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制至今仍然不清楚[2]。本研究采用小鼠離體肥厚心臟模型，探討S1P在缺血后適應(yīng)肥厚心肌中的作用，從而闡述明確IPost對肥厚心肌保護(hù)的作用機(jī)制，以便為臨床研究及其應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑64只C57/BL小鼠(12周齡)，雄性，體重22～25 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。S1P1抑制劑W-146、ERKl/2抑制劑PD98059、氯化三苯四氮唑(Sigma，美國)。動(dòng)物組織線粒體分離試劑盒(Genmed，美國)。生物素原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測試劑盒(Roche，美國)。主要儀器是呼吸機(jī)(Harvard 687，美國)、BL-420生理實(shí)驗(yàn)記錄系統(tǒng)(中國武漢生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法參照李曉梅等[3]的方法，對TAC手術(shù)后的4周小鼠給予麻醉，腹腔注射用量為1 000 U/kg的肝素，并從胸部正中切口，游離主動(dòng)脈弓后快速分離心臟，用4℃的KH液[3]沖洗心臟，并將其主動(dòng)脈弓移接到Langendorff灌流系統(tǒng)上。采用95%氧和5%二氧化碳?xì)饣腒H液，在灌注壓80 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)、灌流液溫度37℃的條件下，以非循環(huán)方式灌注心臟。灌注30 min待心臟穩(wěn)定以后，再經(jīng)過30 min全心缺血和共計(jì)90 min繼續(xù)灌注。將心臟缺血30 min的小鼠隨機(jī)分成4組，每組16只，分別為：(1)缺血再灌注組(IR組)；(2)缺血后適應(yīng)(IPost)組：恢復(fù)灌注前l(fā) min，缺血10 s后繼續(xù)灌注10 s，標(biāo)定為1個(gè)周期，重復(fù)3次，總計(jì)60 s；(3)IPost+ W-146組(S1P1抑制劑)；(4)IPost+PD98059組(ERK1/2抑制劑)。在恢復(fù)再灌注的起始不進(jìn)行IPost，分別給予W-146(濃度為10-3mmol/L)、PD98059(濃度為10-5mmol/L)的KH液持續(xù)灌注15 min后再恢復(fù)無PD98059及W-146的KH液灌注。各組IR結(jié)束后，進(jìn)行心臟血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死范圍檢測，Western印跡方法檢測S1P1、ERK1/2總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平，脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測心肌細(xì)胞的凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來處理相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組離體小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較與IR組、IPost+W-146組與IPost+PD98059組相比較，IPost組小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左心室收縮壓、左室壓力上升最大速度顯著降低(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(±s，mmHg)

表1 各組小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(±s，mmHg)

注：α表示與其他三組比較，IPost組的左心室收縮壓(mmHg)、左室壓力上升最大速度(mmHg)明顯降低(P＜0.05)。

組別左心室收縮壓左室壓力上升最大速度I R組I P o s t組I P o s t + W -1 4 6組I P o s t + P D 9 8 0 5 9組8 5 ± 5 6 6 ± 6a8 3 ± 4 8 4 ± 5 3 7 7 8 ± 2 3 0 2 8 2 0 ± 2 2 0a3 7 7 0 ± 2 2 5 3 6 6 9 ± 2 2 8

2.2 心肌梗死范圍的測定IPost組較IR組心梗面積明顯縮小[(23.6±2.8)%vs(40.2±4.6)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而IR組[(40.2±4.6)%]、IPost+W-146組[(39.7±2.8)%]、IPost+PD98059組[(42.4±3.6)%]三組心肌梗死面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。可知應(yīng)用W-146、PD98059對缺血再灌注心肌梗死范圍無影響，W-146、PD98059能夠消除IPost對心臟的保護(hù)作用。

2.3 ERK1/2蛋白表達(dá)和磷酸化狀態(tài)對以上4組離體心臟經(jīng)過30 min缺血、90 min繼續(xù)灌注以后，各組蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。90 min IPost組的心肌p-ERK1/2表達(dá)較IR組明顯上升[(0.28±0.02)vs(0.08±0.03)，P＜0.05]，IR組、IPost+ W-146組、IPost+PD98059組的心肌p-ERK1/2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明ERK1/2信號途徑參與介導(dǎo)肥厚心肌缺血后適應(yīng)保護(hù)，見圖1。

2.4 S1P1蛋白的表達(dá)對以上4組離體心臟經(jīng)過30 min缺血、90 min繼續(xù)灌注后，檢測心肌組織中S1P1蛋白表達(dá)差異。結(jié)果顯示與IR組比較，IPost組、IPost+W-146組及IPost+PD98059組的心肌S1P1表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，見圖2。

圖1 Western blot檢測各組ERK1/2及磷酸化ERK1/2的水平

圖2 Western blot檢測各組小鼠離體肥厚心肌S1P1的水平

2.5 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡IPost組Bcl-2的表達(dá)較其他各組明顯升高(P＜0.05)，Bax的表達(dá)較其他各組明顯降低(P＜0.05)。IR組、IPost+ W-146組、IPost+PD98059組Bcl-2和Bax之間比較，其χ2值分別為26.48、29.06、34.85；P值分別為0.061、0.051、0.056，表明各組Bcl-2和Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 Western blot檢測各組凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)

3 討論

缺血再灌注損傷是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)課題，目前國內(nèi)外研究資料顯示，脊髓、腦、心臟等器官在缺血發(fā)生后施行缺血后適應(yīng)處理，能夠減少再灌注損傷，對機(jī)體起到保護(hù)作用，具有較高的臨床價(jià)值[4]。根據(jù)張健發(fā)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，以小鼠為動(dòng)物模型，在再灌注開始之前進(jìn)行缺血后適應(yīng)，與預(yù)適應(yīng)一樣也可以減輕再灌注損傷。應(yīng)用到臨床心肌梗死時(shí)，通過酶的釋放監(jiān)測指標(biāo)可以顯示心肌梗死程度面積減少，癥狀得到了減輕[6]。IPost的作用機(jī)制是：首先IPost能夠抑制中性粒細(xì)胞的聚集從而提高內(nèi)皮細(xì)胞功能；其次抑制氧化應(yīng)激，還能降低線粒體中Ca2+濃度，減少再灌注產(chǎn)生有害物質(zhì)，從而減少對心肌細(xì)胞的損害；接著它能減輕心肌水腫，從而改善血管內(nèi)皮的功能，然后減少心肌再灌注損傷[7]，達(dá)到保護(hù)心肌的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，肥厚心肌IPost以后，心肌梗死的范圍明顯低于IR組，由此可知IPost在肥厚心肌缺血再灌注中起一定的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，IPost組小鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左心室收縮壓、左室壓力上升最大速度相比IR組顯著降低(P＜0.05)，其他三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPost組較IR組、IPost+W-146和IPost+PD98059能明顯降低肥厚心肌的心梗面積、改善心功能并能減少心肌細(xì)胞的凋亡率，增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，并且p-ERK、S1P1的表達(dá)上明顯升高，而加有W-146、PD98059的IPost組的心梗面積、心功能以及Bcl-2、Bax、p-ERK1/2和S1P1的表達(dá)較IR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果證明IPost對肥厚心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用，并且此保護(hù)作用可能是通過S1P及ERK1/2信號通路實(shí)現(xiàn)的，這與國外的研究[8]一致。另外，根據(jù)研究[9]發(fā)現(xiàn)，S1P還可通過以下三個(gè)方面來保護(hù)心臟：一是減少肌酐酶釋放；二是改善血液動(dòng)力學(xué)；三是能夠減少梗塞面積[10]。這需要進(jìn)一步去研究和證實(shí)。

綜上所述，IPost能有效地減輕離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷，其作用可能是通過S1P結(jié)合S1P1后激活ERK1/2信號通路實(shí)現(xiàn)的，為急性心肌梗死合并左室肥厚患者減輕心肌缺血再灌注損傷、改善預(yù)后提供了一個(gè)新的治療思路，同時(shí)S1P受體及其信號傳導(dǎo)通路的激動(dòng)劑或阻斷劑將成為一些疾病新的作用靶點(diǎn)，為預(yù)防和治療疾病提供新的思路。

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Effects of ischemic postconditioning on hypertrophic myocardium by sphingosine-1-phosphate signal transduction pathways.

LI Hai-xia1,2,LI Xiao-mei2,CHEN Bang-dang3,LIU Fen3,YANG Yi-ning3,GAI Min-tao2, CHEN Xiao-cui3,MA Yi-tong2.1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urümqi 830011,Xinjiang,CHINA;2.Heart Center,the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA;3.The First Clinical Medical College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning(IPost)in protecting hypertrophic myocardium subjected to ischemic re-perfusion(IR)and to study the role of Sphingosine-1-phosphate in mediating such protection.MethodsTransverse aortic constriction(TAC)operation was performed on 12-week-old C57/ BL mice to establish left ventricular hypertrophy models.Sixty-four isolated TAC mouse hearts were mounted onto the Langendorff perfusion system and equally divided into four groups:IR group[undergoing stable perfusion for 30 min,ischemic for 30 min,and re-perfusion for 90 min(an IR cycle)to cause hypertrophic myocardium IR injury],IP-ost group[undergoing ischemic for 10 s and re-perfusion 10 s,totally 3 cycles(60 s)before re-perfusion for 90 min], IPost+W-146 group and IPost+PD98059 group.Hemodynamic examination was conducted 90 min after re-perfusion to measure the left ventricular systolic pressure(LVSP),left ventricular end diastolic pressure(LVEDP),maximal uprising velocity of left ventricle pressure(dp/dtmax),and minimal uprising velocity of left ventricle pressure(dp/dtmin).After the IR procedure the myocardium of the left ventricle was isolated to detect the infarction size(IS).Western blotting was used to detect the protein expression of S1P1,ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2.TUNEL was used to detect the apoptosis rate.ResultsCompared with IR group,the LVSP levels of the IPost group were significantly higher[(66±6)mmHg vs(85±5)mmHg],the dp/dtmax were significantly decreased[(2 820±220)mmHg vs(3 778±230)mmHg],and the infarction size was significantly reduced[(23.6±2.8)%vs(40.2±4.6)%],all with P＜0.05. However,the results of the IPost+inhibitor groups(IPost+W-146 group and IPost+PD98059 group)showed that in the first 15 min of re-perfusion addition of W-146 and PD98059 reversed all changes observed in the IPost group and eliminated the IPost protection by increasing infarction size to a level similar to that in the IR group.Compared with the IR group,the protein levels of S1P1,phosphorylated ERK1/2 of the IPost group were all significantly higher.IP-ost+W-146 group and PD98059 group showed no statistically significant difference with the IR group in the above-mentioned parameters(P＞0.05).Results of TUNEL assay test showed that the expression of IPost group's Bcl-2 was significantly higher than the other groups,and the expression of Bax was significantly lower than the other groups(P＜0.05).ConclusionIPost has protective effect in hypertrophic myocardium with IR injury in vitro.The cardioprotective effects of IPost may involve in the regulation of ERK1/2 signal pathway through S1P signal transduction pathway.

Sphingosine-1-phosphate;Sphingosine-1-phosphate receptor 1;Hypertrophic myocardium; Ischemic re-perfusion;Ischemic postconditioning

R-332

A

1003—6350（2015）01—0001—04

2014-04-22)

國家自然科學(xué)基金(編號：81060021)；國家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科專項(xiàng)科研基金(新教師基金，編號：20106517120001)；新疆自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號：XJEDU20-10I29)；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研專項(xiàng)基金(編號：2010YGY007)

李曉梅。E-mail：lixm505@163.com