張虹 楊鳳敏 李風(fēng)月 沈剛 楊月陽 王曉杰 張淼 唐亞林

1 中國科學(xué)院化學(xué)研究所 （北京 100190）

2 北京康健源科技有限公司 （北京 100055）

3 北京國醫(yī)械華光認(rèn)證有限公司 （北京 100011）

4 新鄉(xiāng)市駝人醫(yī)療器械有限公司 （新鄉(xiāng) 463400）

0.前言

聚氯乙烯（PVC）類材料在醫(yī)療設(shè)備中有著 廣泛的應(yīng)用。通常所使用的PVC 類產(chǎn)品中都含有鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）增塑劑。DEHP 可以提高塑料的柔軟性和耐寒性，降低軟化溫度，改善加工性能。DEHP 的急性毒性很小，但其亞急性毒性動物試驗顯示能導(dǎo)致體重減輕、白細(xì)胞計數(shù)增高、血紅蛋白值下降、血尿等，特別是對肝腎功能與生殖功能具有不良影響。另外，DEHP 可導(dǎo)致胎兒死亡率及胎兒畸形率明顯增加。因此，需要對PVC 醫(yī)療器械中DEHP 的溶出量進(jìn)行檢測，用以確保PVC 醫(yī)療器械產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的安全性。

近期研究表明，脂溶性藥液可以導(dǎo)致PVC 產(chǎn)品中DEHP 的溶出[1～3]。脂肪乳注射液是由精制大豆油、甘油、精制卵磷脂等制成的靜脈輸注藥液。目前，脂肪乳注射液已廣泛應(yīng)用于手術(shù)前后、腫瘤、長期昏迷等不能進(jìn)食或大面積燒傷等需要補(bǔ)充脂肪營養(yǎng)的病人或嬰兒。脂肪乳注射液屬于脂溶性藥液，對于DEHP 具有較強(qiáng)溶出效果。但因脂肪乳的成分較為復(fù)雜，在進(jìn)行分析檢測時難度較大，所以至今還鮮有關(guān)于脂肪乳注射液對于DEHP 溶出量的檢測報道[4]。鑒于此，我們利用高效液相色譜（HPLC），建立了脂肪乳注射液的DEHP 溶出量檢測方法。并利用上述方法，在模擬臨床最惡劣使用條件下，考察了PVC 產(chǎn)品在脂肪乳注射液中DEHP 的溶出情況。

1.材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙醇（色譜純，百靈威），純水（MiLLiQ 超純水），DEHP 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Fluka，批號：SZB8301XV，編號：36735-1G），脂肪乳注射液（規(guī)格：250mL: 25g；生產(chǎn)廠家：成都科侖藥液股份有限公司），分析天平（METTLER TOLEDO AB135-S），高效液相色譜（Shimadzu 20A），一次性使用輸液連接管（新鄉(xiāng)市駝人醫(yī)療器械有限公司，批號：101212）。

1.2 浸提液的制備

1.2.1 DEHP 的浸提實驗

脂肪乳注射液在臨床使用過程中，一次滴注250～500mL，一日一次。按照臨床的最大給藥劑量，我們量取500mL，采用循環(huán)泵系統(tǒng)，在模擬臨床自然滴注的最慢流速（約為1mL/min）的情況下，對一次性使用輸液連接管產(chǎn)品中的DEHP 進(jìn)行浸提。

1.2.2 浸提液的萃取因脂肪乳成分比較復(fù)雜，無法將浸提后的樣品直接進(jìn)入 HPLC 進(jìn)行檢測，需要前期進(jìn)行萃取處理。萃取時，精密吸取浸提后的脂肪乳溶液250 mL，置于分液漏斗中，分別用不同體積的正己烷溶劑進(jìn)行萃取，并對萃取效果進(jìn)行對比，確定浸提液的萃取實驗參數(shù)。萃取后的溶液，合并后放入真空干燥箱中干燥，干燥完全后用乙醇溶解，利用HPLC 進(jìn)行DEHP 浸出量的檢測。

1.3 色譜條件

檢測器：紫外/可見光檢測器；檢測波長n = 272 nm；色譜柱：Sunfire C18, 5μm, 4.6 mm×250 mm；柱溫：室溫；流動相：甲醇-水（95-5）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 方法學(xué)研究

1.4.1DEHP 特征吸收波長的測定

精密稱取 DEHP 標(biāo)準(zhǔn)品0.2 mg，用乙醇稀釋至4 mL，配制成約含50 μg /mL 的溶液，用紫外-可見分光光度計在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行波譜掃描，根據(jù)吸收光譜曲線確定DEHP 的HPLC 檢測波長（n）。

1.4.2 DEHP 保留時間的確定

考慮到所用浸提液中也可能含有一定量的 DEHP，因此，對浸提液進(jìn)行檢測，在測定樣品時扣除這部分的干擾，將空白的溶劑作為空白溶液。

稱取DEHP 適量，用乙醇稀釋配置得到100 μg/mL 的溶液作為對照品溶液。在1.3 色譜條件下分別將空白溶液、對照品溶液與測試溶液注入高效液相色譜，記錄色譜圖，得到DEHP 的出峰保留時間。

1.4.3DEHP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取 DEHP 對照品適量，置于容量瓶中，以乙醇為溶劑，配制濃度約為2 mg/mL 的DEHP乙醇溶液，取此溶液5 mL 置于50 mL 量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液。精確量取此溶液適量，置于容量瓶中，用乙醇稀釋分別配制成濃度為200 μg/mL～0.020 μg/mL 的溶液作為供試品溶液。按照1.3 中色譜條件進(jìn)樣測定，得到各個濃度的峰面積值。以樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.4.4 溶液穩(wěn)定性的測定

量取 DEHP 對照品適量（約10 mg），置10 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。取此溶液1 mL 置10 mL 量瓶中用浸提液稀釋定容，分別在0h、4h、8h、12h、24h 小時，按照1.3 色譜條件對此溶液進(jìn)行測定，考察峰面積的變化。

1.4.5 進(jìn)樣精密度

取溶液穩(wěn)定性樣品，按照1.3 的色譜條件連續(xù)測定5 次，得到其峰面積，計算變異系數(shù)（RSD），考察實驗結(jié)果的重復(fù)性。

1.4.6 回收率

精密量取 DEHP 對照品適量（約相當(dāng)于DEHP 8 mg、10 mg 和12 mg），各3 份，分別置于10 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。取此溶液1 mL 置10 mL 容量瓶中用浸提輸液器24 h 的供試品溶液稀釋定容，作為80%、100%、120%的供試溶液；另取DEHP 對照品適量（約10 mg），置10 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。取此溶液1 mL 置10 mL 量瓶中用乙醇稀釋定容，作為對照溶液；以乙醇溶液作為空白溶液，以9 mL 浸提輸液器24 h 的溶液和1 mL 的乙醇溶液作為樣品溶液。分別取上述四種溶液，分別取上述四種溶液，按照1.3 的色譜條件進(jìn)行測定，計算3 種不同濃度溶液的回收率（%）。

2.結(jié)果與討論

2.1DEHP 特征吸收波長的確定

DEHP 的紫外吸收光譜圖，如圖1 所示。從圖中可以看出DEHP 在274 nm 處有最大吸收，選定274 nm 為檢測波長。

2.2 浸提液萃取次數(shù)的確定

精密吸取浸提后的脂肪乳溶液 250 mL，置于分液漏斗中，分別精密加入250mL、500 mL（分兩次萃取）和750 mL（分三次萃?。┑恼和槿軇┻M(jìn)行萃取。萃取后，合并上清液后放入真空干燥箱中干燥，干燥完全后用乙醇溶解后取此溶液進(jìn)樣，按照1.3 的藥效液相色譜方法，對比不同體積下的DEHP 的浸出量，結(jié)果如表1 所示。結(jié)果表明，隨著萃取次數(shù)和萃取溶液體積的增加，浸提出的DEHP 量也有所增加，等體積萃取兩次和等體積萃取三次的時候結(jié)果接近，因此選擇等體積萃取兩次作為浸提液的后處理方法。

2.3 DEHP 的出峰保留時間

圖1. DEHP 的紫外吸收光譜

表1. 浸提液萃取結(jié)果

表2. DEHP 溶液濃度及對應(yīng)的峰面積

表3. 溶液穩(wěn)定性實驗結(jié)果

圖2. DEHP 的HPLC 保留時間。A：空白溶液；B：DEHP 對照品；C：樣品

圖3. DEHP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取 DEHP 對照品適量約（10 mg），用乙醇超聲溶解定容，配制成約100 μg/mL 的溶液作為對照品溶液。取3 套樣品和玻璃燒瓶連成一循環(huán)系統(tǒng)，加入500mL 脂肪乳注射液并保持在37?C±1?C，通過一蠕動泵作用于一段盡可能短的易用硅膠管上，使浸提液以1mL/min 的流量循環(huán)，經(jīng)24 h 分別收集浸提液并冷卻至室溫后用脂肪乳定容到500 mL，取250 mL 浸提液用正乙烷萃取。將萃取液在真空干燥箱中干燥后，用250 mL 乙醇溶解，作為供試品溶液。在同樣的條件下，將脂肪乳注射液利用上述萃取的方法進(jìn)行萃取，萃取后的溶液作為空白溶液。

在1.3 色譜條件下分別將空白溶液、對照品溶液與測試溶液注入高效液相色譜，記錄色譜圖，得到DEHP 的出峰保留時間，如圖2 所示。

實驗結(jié)果表明，空白溶液對DEHP 的測定無干擾，DEHP 對照樣品溶液的主峰保留時間為10.505 min，供試品溶液的主峰保留時間為 10.563 min，兩峰的保留時間基本一致，說明供試品溶液的主峰為DEHP 的色譜峰，DEHP 的峰與鄰近的雜質(zhì)峰分離度良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確稱取 DEHP 對照品適量，置于量瓶中，以乙醇為溶劑，配制濃度約為2 mg/mL 的DEHP 乙醇溶液，取此溶液5 mL 置于50 mL 量瓶中，用浸提液稀釋至刻度作為儲備液。分別精確量取此溶液適量，分別置于量瓶中，用浸提液稀釋分別配制成濃度為200 μg/mL 、140 μg/mL 、100 μg/mL、60 μg/mL、20 μg/mL、2 μg/mL 和0.020 μg/mL 的溶液作為供試品溶液。按照1.3 的色譜條件，量取空白溶液和7 個濃度的供試品溶液各20μL 注入液相色譜儀，以樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。 實驗結(jié)果表明，DEHP 在0.020～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性方程的R 值為1.000，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 溶液穩(wěn)定性

取 DEHP 對照品適量（約10 mg），置10 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。取此溶液1 mL 置10 mL 量瓶中用浸提液稀釋定容，分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h 用1.3 所述方法對溶液進(jìn)行測定，考察峰面積的變化，實驗結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，溶液在室溫條件下放置24 小時，溶液穩(wěn)定性試驗中溶液峰面積的RSD 值為0.35%，小于2%，說明溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度

取溶液穩(wěn)定性下樣品，按照1.3 的色譜方法進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣5 次，計算RSD 值，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明，按此方法重復(fù)測定樣品的峰面積， RSD 值為0.26%，小于2%，說明測定方法重復(fù)性良好。

表4. 進(jìn)樣精密度實驗結(jié)果

表5. 脂肪乳注射液的回收率對照實驗結(jié)果

表6. 脂肪乳注射液的回收率實驗結(jié)果

表7. 脂肪乳注射液對一次性使用輸液連接管中DEHP 的對照品實驗結(jié)果

表8. 脂肪乳注射液對一次性使用輸液連接管中DEHP 的溶出實驗結(jié)果

2.7 回收率結(jié)果

回收率結(jié)果見表 5 和表6。9 份樣品溶出度的回收率平均值分別為100.73%、99.52%、101.45%，均在90.0%～110.0%之間，RSD 值為1.35%，回收率良好，表明本實驗采用的測量方法準(zhǔn)確度高，精確度好。

2.8 產(chǎn)品DEHP 溶出量的檢測

利用 1.3 色譜方法，以脂肪乳注射液為浸提液對一次性使用輸液連接管產(chǎn)品中的DEHP 溶出量進(jìn)行測定，結(jié)果見表7 和表8 所示。1#樣品和2#樣品的DEHP 溶出量分別為0.12 mg/套（樣品1）和0.10 mg/套（樣品2），均值為0.11mg/套。

3.結(jié)論

美國食品與藥品管理局（FDA）在2002 年7 月12 日發(fā)表了關(guān)于DEHP 增塑PVC 醫(yī)療器械安全性評價的研究報告，在研究報告的通告中提出要重視和監(jiān)控醫(yī)療器具中DEHP 的釋放[5]。脂肪乳注射液是由精制的植物油(大豆油、棉子油、麻油等)與乳化劑等組成的靜脈輸注脂溶性藥液，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床?？紤]到DEHP 具有一定的脂溶性，并根據(jù)化合物相似相溶的原理可知，脂肪乳注射液對于DEHP 具有一定的溶出作用。同時，因為脂肪乳注射液成分較為復(fù)雜，所以利用高效液相色譜（HPLC）無法直接進(jìn)行DEHP 溶出量的檢測。本文中，我們首先采用萃取的方法，對脂肪乳浸提液進(jìn)行萃取，并對萃取參數(shù)進(jìn)行了摸索。而后利用HPLC 對萃取液中的DEHP 進(jìn)行含量測定。同時，為了盡可能模擬出脂肪乳注射液在臨床使用過程中DEHP 的最大溶出量，選用了該藥液在臨床使用過程中的最大使用劑量（500mL/天），并在37?C 條件下，進(jìn)行浸提。

實驗結(jié)果表明，將脂肪乳浸提液萃取后的溶液，在以甲醇-水（95:5）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為274nm 的色譜條件下，DEHP 的保留時間為10.563 min，DEHP 的出峰時間與鄰近雜質(zhì)峰分離度良好，可以直接進(jìn)行檢測。按照上述實驗參數(shù)，本次實驗測定的一次性使用輸液連接管產(chǎn)品，在脂肪乳注射液中DEHP 的溶出量為0.11mg/套。該方法可以較為快捷的檢測脂肪乳注射液中的DEHP 溶出量。同時通過精密度、線性、回收率等實驗也證實，該實驗方法準(zhǔn)確度高、精密度好，可確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠。

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[2] 張恩娟，陳琳，曹健.紫杉醇注射液配套輸液器中鄰苯二甲酸二辛酯的溶出性考察.中國藥房，2008，19（9）：698-700.

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