沈淑蓉

(溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

胃癌組織miRNA-433的表達(dá)情況及其影響因素分析

沈淑蓉

(溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目的:分析熒光定量PCR法檢測(cè)胃癌血清中miRNA-433的表達(dá)情況，探討miRNA-433在胃癌檢測(cè)中的意義。方法:設(shè)計(jì)miRNA-433和U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物，以U6為內(nèi)參利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常對(duì)照組、胃竇潰瘍組、胃竇炎性息肉組及胃癌組的miRNA-433表達(dá)情況，并將術(shù)前與術(shù)后的miRNA-433表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果:胃癌組患者的miRNA-433表達(dá)水平明顯均高于正常對(duì)照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論:熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以運(yùn)用于檢測(cè)胃癌的早期診斷和分期，具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步推廣。

熒光定量PCR法;血清miRNA-433;表達(dá)情況;應(yīng)用效果

胃癌屬于一種惡性腫瘤，常發(fā)生于胃黏膜上皮細(xì)胞，其發(fā)病率高，給患者的生命健康造成很大的威脅。胃癌的早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)為胃鏡及病理學(xué)診斷，現(xiàn)今，血清腫瘤標(biāo)記物(如癌胚抗原)也逐漸開(kāi)始應(yīng)用于檢測(cè)腫瘤，但其對(duì)胃癌診斷的敏感性和特異性相對(duì)較低［1-2］。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種普遍存在于多種細(xì)胞生物中的內(nèi)源性、非編碼小RNA分子，長(zhǎng)19-22個(gè)核苷酸，約占基因總數(shù)的2%［3］。本研究就熒光定量PCR法在胃癌血清miRNA-433檢測(cè)中的應(yīng)用效果報(bào)道如下［1］。

一、材料與方法

(一)材料。

1.標(biāo)本收集。2010年10月-2012年10月我院收治106例患者。其中30例未經(jīng)放化療的胃癌患者，其中男17例，女13例，年齡42-67歲，平均年齡為(53.8±8.7)歲;正常人員30例，年齡41-64歲，平均年齡為(51.8±13.5)歲;胃竇潰瘍患者27例，年齡40-66歲，平均年齡為(53.2±14.3)歲;胃竇炎性息肉患者19例，年齡43-63歲，平均年齡為(52.6± 15.7)歲。

2.主要試劑和儀器。Trizol試劑;miRNA-433熒光定量PCR試劑盒;逆轉(zhuǎn)錄所需的dNTPs及逆轉(zhuǎn)錄酶、100bp DNAL adder Marker;ABI Prism7000熒光定量PCR儀;Biophotometer生物分光光度計(jì)。

(二)方法。

1.總RNA提取。采用Trizo法分別提取胃癌組織、正常組織、胃竇潰瘍組織、胃竇炎性息肉及其癌旁組織的總RNA，Biophotometer生物分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，1.2%的甲醛變性凝膠電泳［2］。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中miRNA-433含量。以RNA為模板，分別以miRNA-433和U6反轉(zhuǎn)錄引物行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 60min，85℃ 5s，獲得小鼠肝臟組織的miRNA-433和U6 cDNA。分別以miRNA-433和U6 cDNA為模板，以miRNA-433和U6的特異性引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)參數(shù)為95℃10min預(yù)變性，95℃15s，60℃30s熒光檢測(cè)1次，共40個(gè)循環(huán)。

(三)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)miRNA-433基因相對(duì)表達(dá)量不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件，故只能以M(P25，P75)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行，并利用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。當(dāng)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié) 果

胃癌組、胃竇潰瘍組、胃竇炎性息肉組及正常對(duì)照組的miRNA-433相對(duì)表達(dá)量分別為1.99(0.96，2.51)、1.25 (0.97，2.36)、1.31(1.13，2.66)及0.03(0.02，0.05)。胃癌組患者的miRNA-433表達(dá)水平明顯均高于正常對(duì)照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組［4］，具有顯著性差異(P＜0.05) (見(jiàn)附表)。

三、討 論

本次實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測(cè)胃患者血清中的miRNA-433表達(dá)情況，設(shè)計(jì)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過(guò)熔解曲線的分析結(jié)果可以看出基本沒(méi)有引物二聚體的形成，證明了反應(yīng)具有特異性。結(jié)果顯示胃癌組患者的miRNA-433表達(dá)水平明顯均高于正常對(duì)照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組(P＜0.05)，而正常對(duì)照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組之間相比較則無(wú)顯著性差異(P＞0.05);術(shù)前miRNA-433表達(dá)水平明顯均高于術(shù)后，具有顯著性差異(P＜0.05)。這與相關(guān)報(bào)道一致。綜上所述，熒光定量PCR法可以較為精確顯現(xiàn)出胃癌患者血清中miRNA-433的表達(dá)水平，進(jìn)而為胃癌的早期診斷提供參照指標(biāo)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附表 熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-433在各組血清中的表達(dá)情況比較

［1］王君輔，李紅浪，謝 勇，等.循環(huán)microRNA在胃癌診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2012，33(24):3828-3831.

［2］張晟春，王 燕，張興毅，等.兩種熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)乳腺癌組織中微小RNA-21的應(yīng)用分析［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，16(20):624-628.

［3］馬文靜，李 魯，呂國(guó)棟，等.SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)微小RNA 21的方法建立及在食管鱗癌中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)，2010，20(1):45-48.

［4］陳文璟，溫旺榮.SYBR green I熒光定量PCR檢測(cè)宮頸癌血清中miR-21的表達(dá)［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29(7):523-525.

R735

A

1002-1701(2015)07-0126-02

2014-10

沈淑蓉，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向:腫瘤生物學(xué)行為研究。

溫州市科技局課題，胃癌淋巴轉(zhuǎn)移特異性血清microRNA的篩選與鑒定(編號(hào)Y20110136)。

10.3969/j.issn.1002-1701.2015.07.066