金朝暉，陳 瓊，趙樹(shù)楠，林 凌*

（安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

纖維素酶是指能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶，為起協(xié)同作用的多組分酶系[1]，其應(yīng)用范圍涉及醫(yī)藥、紡織、日用化工、造紙、食品發(fā)酵、工業(yè)洗滌、煙草、石油開(kāi)采、廢水處理及飼料等各個(gè)領(lǐng)域。在釀造行業(yè)中，纖維素酶能夠起到提高酒類(lèi)產(chǎn)品的出酒率，改善酒的品質(zhì)，增加果酒口感的作用；同時(shí)也能夠提高醬油、食醋的產(chǎn)量，增加調(diào)味品的風(fēng)味[2]。此外，纖維素酶在廢棄生物質(zhì)能源利用開(kāi)發(fā)方面，具有巨大的潛在價(jià)值。合理有效地利用與轉(zhuǎn)化地球上的纖維素原料，對(duì)于解決工農(nóng)業(yè)環(huán)境污染、當(dāng)今石油能源危機(jī)具有重要現(xiàn)實(shí)意義[3]。相對(duì)于最適催化溫度為50～60 ℃的中溫型纖維素酶，適冷型纖維素酶能夠在自然條件（10～30 ℃）維持較高的酶活力和催化效率，大大縮短處理過(guò)程的時(shí)間并節(jié)省昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用[4]。因此研究與發(fā)掘適冷型纖維素酶，能夠有效地減少工藝流程并降低生產(chǎn)成本[5-7]。

實(shí)驗(yàn)樣品取自青海高寒地區(qū)，利用其獨(dú)特的低溫環(huán)境篩選出所需要的具有適冷型纖維素酶的目的菌株[6]，為纖維素酶的發(fā)掘與利用提供了一定的研究思路與基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集自青海茶卡鹽湖地區(qū)，取樣坐標(biāo)為東經(jīng)99°02′，北緯36°45′。

1.1.2 試劑

剛果紅染色液：稱取剛果紅粉末溶解于蒸餾水中，終質(zhì)量濃度為1 g/L。

剛果紅脫色液：終濃度為1 mol/L 的NaCl 溶液。

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑：分別稱取NaOH 104 g、3,5-二硝基水楊酸30 g、純酒石酸鉀鈉910 g、重蒸苯酚25 g和無(wú)水亞硫酸鈉25 g溶于2 500 mL蒸餾水，貯存于棕色瓶中避光保存，放置一星期后過(guò)濾使用。

5 g/L羧甲基纖維素鈉（carboxymethylated cellulose-Na，CMC-Na）溶液：準(zhǔn)確稱取0.50 g 羧甲基纖維素鈉用pH 8.0磷酸緩沖液溶解并定容至100 mL。

1.1.3 培養(yǎng)基

纖維素富集培養(yǎng)基（1 L）：MgSO40.1 g，CaCl20.1 g，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO42.0 g，KH2PO40.5 g，NaCl 6 g，瓊脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH值調(diào)節(jié)至7.0。

纖維素篩選培養(yǎng)基（1 L）：在上述纖維素酶富集培養(yǎng)基中加入酵母粉1 g。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，纖維素0.1%，pH調(diào)節(jié)至7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

iCycler型PCR儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；SKY2102C型恒溫?fù)u床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；UV-1700型紫外分光光度儀：日本島津公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；5415D型臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩

稱取土壤樣品1 g，添加到100 mL無(wú)菌水中充分混勻，然后按10倍稀釋法依次添加無(wú)菌水稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。取10-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度的菌懸液各0.1 mL涂布于纖維素富集培養(yǎng)基平板上，置入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

1.3.2 產(chǎn)纖維素酶菌株復(fù)篩

挑取單一菌落接種于纖維素篩選培養(yǎng)基上，置入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，向培養(yǎng)皿中加入剛果紅染液染色10 min，倒去染液，再加入脫色液浸泡5 min進(jìn)行脫色處理，依據(jù)透明圈直徑和菌落直徑比值的大小篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株[8]。

1.3.3 粗酶液的制備

將分離得到的菌落接種于25 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min搖床中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵90 h；將所得發(fā)酵液進(jìn)行4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液，用于測(cè)定纖維素酶的活力。

1.3.4 纖維素酶酶活力測(cè)定

參照穆春雷等[9]所述的方法，并加以適當(dāng)修改，測(cè)定樣品的纖維素酶酶活力。

以50 mL 5 g/L CMC-Na（pH 8.0的磷酸緩沖液配制）為底物，加入50 mL酶液，35 ℃水浴反應(yīng)30 min后，加入100 mL DNS顯色液，沸水浴煮5 min，取出后在流水下迅速冷卻后定容至1 mL搖勻，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值。在此實(shí)驗(yàn)條件下，1 mL酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量作為1個(gè)酶活單位，用U/mL表示。

1.3.5 細(xì)菌的分子鑒定

以TIANGEN基因組純化試劑盒提取待測(cè)菌株基因組DNA，用16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，引物27 F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和1492 R（5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）各0.5 μL，4 μL dNTP、5 μL 10×PCR Buffer，3 μL Mg2+，0.5 μL rTaq，35.5 μL雙蒸水。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，32個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，并通過(guò)Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)分析，確定待測(cè)菌株分類(lèi)地位。

1.3.6 搖瓶產(chǎn)酶研究

將菌種接種于50 mL pH 8.0的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)4 d，按時(shí)測(cè)量液體培養(yǎng)基中菌株的OD600nm值并按DNS法[10-11]測(cè)定其酶活力。

1.3.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

酶的最適溫度測(cè)定是按照酶活測(cè)定方法，取適當(dāng)稀釋的酶液分別在20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下測(cè)定相對(duì)酶活（%）。酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定是將酶液在以上不同溫度條件下保溫1 h，迅速冷卻后，參照1.3.4酶活測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活力（%）。

酶的最適pH值測(cè)定是按照酶活測(cè)定方法，以不同緩沖液（pH值3.0～5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH值5.5～8.0的磷酸鹽緩沖液，pH值8.5～11.0為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）校準(zhǔn)發(fā)酵液的pH值，在酶反應(yīng)的最適溫度條件下測(cè)定酶活性，以最高酶活為100%，參照1.3.4酶活測(cè)定方法計(jì)算各反應(yīng)體系相對(duì)酶活。

酶促進(jìn)劑與抑制劑研究是在相同條件下，向酶液中分別加入不同的離子，包括Li2+、K+、Rb2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS)、（NH4）Cl和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其終濃度為0.1 mmol/L，同時(shí)以未處理的酶液作為100%對(duì)照，在酶反應(yīng)的最適pH值和最適溫度的條件下測(cè)定各離子對(duì)酶活力的影響，以殘余酶活（%）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從青海茶卡鹽湖地區(qū)土壤中所分離的菌株，其菌落形態(tài)如圖1所示，菌落呈淡黃色、圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊。菌株水解圈如圖2所示，菌株在纖維素篩選培養(yǎng)基上形成明顯的透明水解圈，說(shuō)明其具有良好的降解纖維素能力。根據(jù)形態(tài)特征，結(jié)合16S rDNA序列分析數(shù)據(jù)，將該菌株歸為青海瓊斯氏菌屬（Jonesia quinghaiensissp.）[12]。

圖1 菌株的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strains

圖2 篩選菌株的水解圈大小Fig.2 The hydrolyzation circle of screened strains

2.2 菌株的搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)

對(duì)所分離菌種進(jìn)行生長(zhǎng)曲線繪制，并測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的纖維素酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.3 Enzyme production curve of strain

由圖3可知，該菌的各個(gè)生長(zhǎng)階段比較明顯。菌體生長(zhǎng)的延滯時(shí)間較短，13 h后逐步進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；培養(yǎng)50 h后，菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，并于70 h后開(kāi)始進(jìn)入衰退期。相對(duì)酶活曲線顯示，產(chǎn)酶量與細(xì)菌生長(zhǎng)基本保持同步，二者的關(guān)系表現(xiàn)為耦聯(lián)型，即伴隨菌體快速生長(zhǎng)纖維素酶呈積累式增長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)近穩(wěn)定期時(shí)，纖維素酶酶活力達(dá)最大值，為0.3 U/mL。

2.3 菌株酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶的最適溫度與熱穩(wěn)定性

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)相對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on relative enzyme activity

在不同反應(yīng)溫度中分別測(cè)定酶液的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)溫度處于25～45 ℃時(shí)，酶活性表現(xiàn)出較高水平，能維持50%以上的酶活力，其最適反應(yīng)溫度為35 ℃，酶活力達(dá)到0.25 U/mL，具有常溫催化水解纖維素的能力。

將酶液置于在不同反應(yīng)溫度中保溫1 h，迅速冷卻后測(cè)定方法測(cè)定其殘余酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme stability

由圖5可知，該酶在45 ℃時(shí)具有一定的耐受性，保溫1 h仍具有60%以上的活力，而超過(guò)50 ℃酶活力迅速下降，僅維持原酶活的20%左右。

2.3.2 酶的最適pH值

在不同pH值緩沖溶液中分別測(cè)定酶液的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH值對(duì)相對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of pH on relative enzyme activity

由圖6所示，該酶的最適反應(yīng)pH值為8.0，在pH值6.0～10.0的范圍內(nèi)具有較高的活性，pH值范圍較廣泛。

2.3.3 酶促進(jìn)劑與抑制劑研究

在pH值8.0和最適溫度35 ℃的條件下測(cè)定各離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，金屬離子Ca2+、Zn2+對(duì)該酶有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，均在150%以上；Ni2+、K+、Li+、Rb2+對(duì)酶也有不同程度的促進(jìn)作用；而Mn2+、Cu2+、Co2+對(duì)酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，其余離子對(duì)酶的影響不明顯。

圖7 不同離子對(duì)相對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of different ions on relative enzyme activity

3 結(jié)論

本研究以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行富集，從青海省茶卡鹽湖湖灘土壤中分離得到一株產(chǎn)纖維素酶菌株。經(jīng)形態(tài)觀察結(jié)合16S rDNA序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該菌株歸屬于青海瓊斯氏菌屬（Jonesia quinghaiensissp.）[13-14]。

搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)表明，該菌株在接種后45 h達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，酶活伴隨著菌體生長(zhǎng)不斷上升，在45 h時(shí)達(dá)到最高值，此時(shí)酶活力為0.3 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)的初步研究顯示，該菌株產(chǎn)生纖維素酶的最適反應(yīng)pH為8.0，在pH 8.0～9.0之間都能保持較高的酶活；最適反應(yīng)溫度為35 ℃，對(duì)50 ℃以上的高溫較為敏感。二價(jià)金屬離子Ca2+、Zn2+對(duì)該酶有明顯的促進(jìn)作用，Mn2+、Cu2+、Co2+對(duì)酶活力有較強(qiáng)的抑制作用。

纖維素酶分解菌所產(chǎn)生的酶有很多重要的應(yīng)用價(jià)值，但酶促反應(yīng)溫度水平偏高，多處于50～60 ℃之間，在工業(yè)應(yīng)用中需要耗時(shí)、耗能進(jìn)行加熱或冷卻處理[4，15]。該酶具有較高的離子耐受性，催化反應(yīng)溫度接近于酵母生長(zhǎng)發(fā)酵溫度（30 ℃），適用于同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）工藝的開(kāi)發(fā)和利用研究。因而，該產(chǎn)酶菌株具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，對(duì)該酶進(jìn)行深入而細(xì)致的研究，是尋找和提升生物工業(yè)領(lǐng)域技術(shù)的重要手段，也將為研究開(kāi)發(fā)節(jié)能、高效的工業(yè)用酶奠定理論基礎(chǔ)。

[1]ZHANG Y H P.Reviving the carbohydrate economy via multi-product lignocellulose biorefineries[J].J Ind Microbiol Biot,2008,35(5):367-375.

[2]鄧天福，杜開(kāi)書(shū)，李廣領(lǐng).纖維素酶及其在釀造業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：17-19.

[3]SERVICE R F.Cellulosic ethanol:biofuel researchers prepare to reap a new harvest[J].Science,2007,315(5818):1488-1491.

[4]GERDAY C.Fundamentals of cold-active enzymes[M].New York:Springer,2014.

[5]于 鵬，劉靜雯.微生物適冷酶及其應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2014，34（2）：77-81.

[6]KUDDUS M,RAMTEKE P W.Recent developments in production and biotechnological applications of cold-active microbial proteases[J].Crit Rev Microbiol,2012,38(4):330-338.

[7]周寧一.青藏高原微生物多樣性研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（11）：2378.

[8]KIM J M,KONG I S,YU J H.Molecular cloning of an endoglucanase gene from an alkalophilicBacillussp.and its expression inEscherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,1987,53(11):2656-2659.

[9]穆春雷，武曉森，李術(shù)娜.低溫產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及纖維素酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（7）：1193-1201.

[10]謝夏陽(yáng).青霉纖維素酶液體發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2013，32（1）：104-106.

[11]陸文清，劉興海，邢建軍.飼料添加劑-纖維素酶活力的測(cè)定[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[12]SCHUMANN P,CUI X L,STACKEBRANDT E,et al.Jonesia quinghaiensissp.nov.,a new member of the suborder Micrococcineae[J].Int J Syst Evol Micr,2004,54(6):2181-2184.

[13]陳雅娟，董 園，蘆志龍，等.堿性纖維素酶產(chǎn)生菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].廣西科學(xué)，2014，21（1）：28-33.

[14]李文鵬，向 蘭.瓊斯氏菌（Jonesiasp.）YNUCC0043 耐堿木聚糖酶的特性[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006（S1）：459-463.

[15]CUNHA E,HATEM C L,BARRICK D.Natural and designed enzymes for cellulose degradation,advanced biofuels and bioproducts [M].New York:Springer 2013.