董 丹，車振明，楊 娜，周欣悅，關(guān)統(tǒng)偉*

（西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）又名仙人掌桿菌，是芽孢桿菌屬中的一種[1]，分布廣泛，常見于土壤、灰塵和污水中，在植物性食品和許多生熟食品中都常見；是一種好氧性、在厭氧情況下也可很好生長的革蘭氏陽性桿菌[2]。有的蠟樣芽孢桿菌菌株可作為益生菌添加到食品和飼料中；有的菌株則為條件致病菌，容易污染食物，引起人畜腸道疾病，甚至嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染[3]。蠟樣芽孢桿菌存在于生活中的各個地方，如冷藏不當(dāng)?shù)氖澄?、飲水、空氣中等[4-7]。蠟樣芽孢桿菌對人體造成危害的方式主要是通過食物進(jìn)入人體，在人體內(nèi)產(chǎn)生毒素。有的菌株能產(chǎn)生耐熱的催吐毒素，引起嘔吐。剩飯冷藏不當(dāng)后容易產(chǎn)生很多蠟樣芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入人體后或有8～16 h的潛伏期，若食用放置過久的剩飯易出現(xiàn)胃痛、嘔吐癥狀[8-10]，這就是常見的蠟樣芽孢桿菌中毒。此外，人體發(fā)生食物中毒，也可能是由蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性毒素所造成的。基于以上問題，本研究通過檢測豆瓣中分離蠟樣芽孢桿菌的生長特性以及抗生素敏感性能更好地了解蠟樣芽孢桿菌的生長環(huán)境。根據(jù)這些生長特性，可以在豆瓣生產(chǎn)過程中更好地控制生產(chǎn)條件，從而抑制蠟樣芽孢桿菌的生長，保證豆瓣醬的安全性；此外，在日常生活中也可以利用其生長特性來預(yù)防食物因蠟樣芽孢桿菌造成的食物中毒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

實驗所用菌株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為郫縣豆瓣醬中分離所得，編號ZZ1001。

1.1.2 實驗試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、氯化鈉、瓊脂：成都市科龍劑化工廠。

抗菌藥物：本實驗共選用25種常用藥敏試紙，分別為鏈霉素、慶大霉素、青霉素G、可奇霉素、林克霉素、多粘菌素B、奈替米星、奈替米星、呋喃妥因、新生霉素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、妥布霉素、克林霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、諾氟沙星、頭孢噻胯、利福平：杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂1.5 g，水100 mL，調(diào)整pH值至7.2～7.6。

LB培養(yǎng)基（固態(tài)）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SC-316海爾立式冷藏柜：青島海爾特種電冰柜有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TB-214電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蠟樣芽孢桿菌在不同溫度條件下生長研究

菌種的活化：將保存在-20 ℃下的甘油管放置于4 ℃條件下解凍，待甘油完全融化過后，迅速吸取100 μL的菌種保存液于LB培養(yǎng)基上，用涂布棒在無菌條件下涂布均勻后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出明顯的菌落。

將活化蠟樣芽孢桿菌用無菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在無菌操作臺內(nèi)，用涂布棒均勻涂布，再分別置于5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[11]，每個溫度下做3個平行，觀察細(xì)菌生長狀況并計算各個培養(yǎng)基上菌落數(shù)，并計算不同溫度條件下每個培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下生長研究

將活化蠟樣芽孢桿菌用無菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至0.02%的鹽酸以及0.005%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)的pH值分別為3.0、4.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、10.0、11.0的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個pH值條件下做3個平行，觀察細(xì)菌生長狀況并計數(shù)各個pH值培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并計算各個pH值條件下菌落數(shù)的平均值。

1.3.3 蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下生長研究

將活化蠟樣芽孢桿菌用無菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的牛肉膏蛋白胨養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個鹽含量條件下做3個平行，觀察細(xì)菌生長狀況并計數(shù)各個鹽濃度下培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并計算每個鹽含量下菌落數(shù)的平均值。

1.3.4 蠟樣芽孢桿菌的藥敏性研究[12]

將活化蠟樣芽孢桿菌用無菌竹簽蘸取少量菌于2 mL無菌水中，搖勻，然后用移液槍分別移取100 μL稀釋液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，并用無菌鑷子夾取含有抗生素片的藥敏片均勻放在平板上，每個平板放置5種藥片[13]。再分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生。

1.3.5 菌落計數(shù)方法

實驗中菌落數(shù)的計算參考GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌在不同溫度條件下生長狀況

經(jīng)過24 h培養(yǎng)之后，蠟樣芽孢桿菌ZZ1001在不同溫度條件下的生長情況見圖1。

圖1 溫度對菌株ZZ1001生長的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of strain ZZ1001

由圖1可知，菌株ZZ1001在5～35 ℃條件下，隨著溫度的升高，菌落數(shù)增加，在35 ℃時達(dá)到最大值，當(dāng)溫度從35 ℃升至55 ℃時，菌落數(shù)急劇下降。因此，可認(rèn)為菌株生長的最適溫度是35 ℃左右，當(dāng)溫度＜5 ℃或＞55 ℃時，菌株不生長。

2.2 蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下生長情況

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，蠟樣芽孢桿菌在不同pH值條件下的生長情況見圖2。

圖2 pH值對菌株ZZ1001生長的影響Fig.2 Effect of pH on the growth of strain ZZ1001

由圖2可知，菌株ZZ1001在pH值3.0～7.0范圍內(nèi)隨著pH值的升高，菌落數(shù)逐漸增多，在pH值達(dá)到7.0時菌株生長最佳，當(dāng)pH在7.0～10.0，菌落的生長急劇降低，且在pH＞10.0或＜3.0時，菌株停止生長，故菌株ZZ1001的最適生長pH值為7.0。

2.3 蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下生長情況

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，蠟樣芽孢桿菌在不同鹽含量條件下的生長狀況見圖3。

圖3 鹽含量對菌株ZZ1001生長的影響Fig.3 Effect of salt concentration on the growth of strain ZZ1001

由圖3可知，菌株ZZ1001在鹽含量2%時菌落數(shù)達(dá)到最大值，隨著鹽含量的增大，菌落數(shù)逐漸降低，在鹽含量為10%時菌株停止生長。故菌株ZZ1001的最適鹽含量為2%。

2.4 蠟樣芽孢桿菌的藥敏性研究結(jié)果

在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，菌株ZZ1001在不同抗生素抗性試驗結(jié)果見表1。

表1 菌株抗藥性實驗結(jié)果Table 1 Results of strain resistance experiment

從試驗結(jié)果可得：多粘霉素、林可霉素、氨芐西林、羧芐霉素這幾種抗生素對菌株ZZ1001的生長抑制情況非常弱；復(fù)方霉素、萘啶酸、四環(huán)素、利福平這幾種抗生素對菌株ZZ1001的生長具有稍微的抑制情況；慶大霉素、新生霉素、妥布霉素、鏈霉素、氧氟沙星、頭孢西丁、卡那霉素、環(huán)丙霉素、青霉素G、呋喃妥因、諾氟沙星、氯霉素、克林霉素這幾種抗生素對菌株ZZ1001的生長抑制稍強(qiáng)；奈替米星、頭孢噻肟、紅霉素、阿奇霉素這幾種抗生素對菌株ZZ1001的生長抑制最強(qiáng)。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌作為食品腐敗菌，存在于各種食品中，對人體健康帶來了巨大的隱患。從本實驗結(jié)果可看出，為了更好的防止蠟樣芽孢桿菌的滋生，可以通過改變環(huán)境溫度、pH值及鹽含量對其控制。在環(huán)境溫度＜5 ℃或＞55 ℃時或pH值＞10或＜3時蠟樣芽孢幾乎不生長。在鹽含量＞5%時不生長，＜5%時生長緩慢，而鹽含量的高低會影響細(xì)胞膜的通透性，高鹽環(huán)境下由于細(xì)胞膜的滲透作用會導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)離子的流失，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞失水死亡，因此食品在食用前進(jìn)行加熱處理可以很好的殺死蠟樣芽孢桿菌[14-16]，合理的控制鹽濃度也是防止腐敗菌生長的一種方法。25種試驗抗生素中，有21種對蠟樣芽孢桿菌都具有抗性，如紅霉素、阿奇霉素等。因此，這對于醫(yī)藥上研制蠟樣芽孢桿菌引起的各種疾病的針對藥物提供了理論依據(jù)[17]。此次實驗結(jié)果為抑制蠟樣芽孢桿菌的生長或殺滅蠟樣芽孢桿菌提供了理論依據(jù)，也為豆瓣產(chǎn)品品質(zhì)的控制提供基礎(chǔ)。

[1]周幗萍，袁志明.蠟樣芽孢桿菌污染及其對食品安全的影響[J].食品科學(xué)，2007，28（3）：357-361.

[2]SCHOENI J L.Bacillus cereusfood poisoning and its toxins[J].J Food Prot,2005,68(3):636-648.

[3]OZAWA K.Sepsis and meningoencephalitis caused byBacillus cereusin a patient with myelodysplastic syndrome[J].Internal Med,2013,52(17):1987-1990.

[4]白鳳翎，馬春穎，劉 巖，等.食品中微生物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性研究[J].食品科學(xué)，2006，11（5）：17-18.

[5]余傳萍，王 彬.由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒分析[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志，2005，3（11）：1121-1124.

[6]楊潔彬.食品微生物學(xué)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

[7]陳 順，孫翠煥，冀寶營.蠟狀芽孢桿菌LW9809 發(fā)酵條件研究[J].微生物學(xué)雜志，2002（5）：45-47.

[8]LUCA C,PAOLA D,KALLIOPI R.Biodiversity and dynamics of meat fermentations:The contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem[J].Meat Sci,2011,89(1):296-302.

[9]CHEN Q,WEI S,DENG Z,et al.Optimization of DNA extraction from seeds of sorghum sudanense(Piper) Stapf[J].Not Bot Hort Agrobot Cluj,2009,37(1):256-260.

[10]MISHRA M K,RAN N S,RAM A S,et al.A simple method of DNA extraction from coffee seeds suitable for PCR analysis[J].Afr J Biotechnol,2008,7(4):409-413.

[11]周家春.食品工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工藝出版社，2003.

[12]曹偉平，馮書亮，楊更亮，等.抗生素類作為防腐劑對蘇云金桿菌芽孢及伴胞晶體的影響[J].微生物學(xué)通報，2002，29（6）：35-41.

[13]林 毅，陳風(fēng)義，劉 琳，等.蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)青霉素酶的研究進(jìn)展[J].河北工業(yè)科技，2008，25（2）：125-128.

[14]張艷春，賈鈞輝，鄭 宇，等.兩步控制策略優(yōu)化生防菌B579 芽孢生成條件[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，5（13）：23-26.

[15]曾曉希，周洪波，劉飛飛，等.一株膠質(zhì)芽孢桿菌的篩選和鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，32（3）：246-247.

[16]宜 齊，王 冬.世界各國的飲用水衛(wèi)生檢測的微生物限量指標(biāo)[J].檢驗檢疫科學(xué)，2004，6（9）：135-142.

[17]劉建國，裴 炎，叢 威.蠟狀芽孢桿菌S1 發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2001，31（1）：24-25.