陳曦曌，呂 楊，謝院生，陳香美

解放軍總醫(yī)院 腎病科、腎臟疾病國家重點實驗室、國家慢性腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853

組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitorsof metalloproteinases，TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的主要細(xì)胞抑制劑。作為一種分泌性蛋白[1]，其功能主要有增強紅細(xì)胞活性[2]，促進(jìn)細(xì)胞增殖或凋亡等[3-4]，并參與許多細(xì)胞因子的調(diào)控[5]。對大多數(shù)腎臟疾病而言，細(xì)胞外基質(zhì)的積聚起到了極其重要的作用[6]，TIMPs可以通過拮抗MMP的活性、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等途徑，參與腎疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。小RNA干擾[9-10]是生物體內(nèi)存在的一種通過雙鏈RNA來抵御病毒入侵和抑制轉(zhuǎn)座子活動的自然機(jī)制。序列特異的雙鏈小RNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。因此，我們利用這種特異、高效、簡便的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)構(gòu)建TIMP-1低表達(dá)大鼠系膜細(xì)胞模型，并用于研究TIMP-1在系膜細(xì)胞中的功能，以明確其在系膜增殖性腎炎發(fā)生、發(fā)展中的作用，這一發(fā)現(xiàn)對補充和完善該病的發(fā)病機(jī)制和主要病理生理過程意義重大。另外，低表達(dá)模型的建立，對于對照驗證某些靶向藥物的治療效果也具有一定的作用。

材料和方法

1 材料 LipofectamineTMRNAiMAX試劑，Invitrogen公司；FAM標(biāo)記的無義siRNA及3條TIMP1 siRNA(siTIMP1-1，siTIMP1-2，siTIMP1-3)序列由吉瑪基因公司合成；第9代原代大鼠系膜細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院腎臟病國家重點實驗室提供；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM，Gibco公司；Trizol試劑，Ambion公司；RT-PCR試劑盒，TransGen Biotech公司；Taqman探針由美國ABI公司設(shè)計合成并提供；7500型熒光定量PCR儀，Waters公司。

2 siRNA轉(zhuǎn)染第9代大鼠系膜細(xì)胞 第9代大鼠系膜細(xì)胞在37℃ 5% CO2飽和濕度下用15% FCS 1640培養(yǎng)于六孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染前融合度為60% ~ 70%。每孔細(xì)胞加入250μl Opti-MEM和8μl siRNA (對照組為8μl FAM標(biāo)記的無義siRNA)，彈勻，靜置15 ~ 20 min后加入8μl RNAimax再彈勻，靜置15 ~ 20 min，培養(yǎng)12 h后換液，48 h后收集細(xì)胞。

3 轉(zhuǎn)染后大鼠系膜細(xì)胞總RNA提取 用Trizol裂解細(xì)胞，每25 cm2大小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入Trizol 1 ml，氯仿與Trizol比例為1∶5，加入氯仿200μl，充分混勻后于冰上靜置15 min，4℃，12 000 g，離心15 min。取上清后加入等量異丙醇，充分混勻，4℃，12 000 g，離心15 min。去上清，加入1 ml 75%乙醇，混勻，4℃，12 000 g，離心1 min，重復(fù)此步驟1次。小心去除上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風(fēng)靜置干燥3 ~ 5 min。每個EP管加入20μl DEPC水，冰上靜置30 min后用紫外分光光度計測定RNA在260 nm與280 nm處光密度值(OD值)，并計算出濃度。

圖1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染無義siRNA后48 h小鼠系膜細(xì)胞(×100)A： 普通光鏡下視野； B： 熒光顯微鏡下視野； C： 光鏡合并熒光顯微鏡Fig. 1 Fluorescent microscope image of MCs at 48 hours after nonsense siRNA transfecting (×100)A: Light microscope image; B: Fluorescent microscope image; C: Merged image of A and B

4 Taqman探針法檢測TIMP-1的mRNA表達(dá)水平 將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系20μl，包含2×TS Reaction Mix 10μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μl，Anchored Oligo(dT)18 Primer (0.5 ug/μl)1μl。采用7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl，每孔含cDNA 4μl、Taqman探針1μl、RNase-free水5μl、Taqman?Gene Expression Master Mix 10μl，反應(yīng)條件為變性95℃15 s，退火延伸60℃1 min，共40個循環(huán)。每個標(biāo)本同時擴(kuò)增TIMP-1和18 s，采用2-△△CT作為TIMP-1 mRNA的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1 無義siRNA轉(zhuǎn)染小鼠系膜細(xì)胞后的熒光觀察熒光顯微鏡觀察可見，轉(zhuǎn)染siRNA的小鼠系膜細(xì)胞90%可發(fā)出綠色熒光。見圖1。

2 利用Taqman探針法檢測對照組和siRNA組系膜細(xì)胞中TIMP-1的mRNA水平siTIMP1-1組、siTIMP1-2組和siTIMP1-3組細(xì)胞內(nèi)TIMP-1的mRNA表達(dá)水平與對照組相比均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 各組TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量Fig. 2 Relative expression level of TIMP-1 mRNA (aP＜0.01, vs control)

討 論

RNA干擾是一種進(jìn)化上保守的抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制[11]。它通過介導(dǎo)序列特異性的mRNA降解發(fā)揮其沉默效應(yīng)，其主要機(jī)制是轉(zhuǎn)錄后抑制，可分為啟動和效應(yīng)兩個階段，RNA干擾的應(yīng)用已成為抑制特定基因表達(dá)的重要工具[12-14]。目前獲得siRNA的方法主要有體外轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法、載體表達(dá)法等[15]。本研究以TIMP-1為靶基因力求構(gòu)建其siRNA以抑制TIMP-1的表達(dá)，從而建立TIMP-1低表達(dá)的大鼠系膜細(xì)胞模型，后者可用于一系列關(guān)于TIMP-1功能的研究，以明確其在系膜增殖性腎炎發(fā)生、發(fā)展的作用，甚至包括靶向治療藥物的開發(fā)等。

研究表明，同一個mRNA中，針對不同位點的siRNA的沉默效率截然不同，一個或幾個核苷酸的位移就可明顯影響其沉默效率[16]。這有可能是因為這些靶mRNA常形成復(fù)雜的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，影響siRNA反義鏈與之堿基配對結(jié)合，進(jìn)而影響RNAi效率。除此之外，還有許多因素會影響siRNA的活性，如靶mRNA的結(jié)構(gòu)、siRNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性和siRNA的堿基特征等[17]。因此，我們需要精心設(shè)計siRNA序列以達(dá)到有效的沉默效果。在本研究中，我們設(shè)計了3種不同的siRNA序列，并從中篩選出最佳的序列用于今后的實驗研究。

TIMP-1作為基質(zhì)金屬蛋白酶的主要抑制物之一，與許多腎疾病的關(guān)系密切。曾有研究[18]報道，MMP-9/TIMP-1失衡參與了IgA腎病的腎小球硬化過程。與此同時，TIMP-1通過對MMPs的抑制，下調(diào)了細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程，并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚，這一點在腎纖維化中起關(guān)鍵作用[19]。因此，我們通過小RNA干擾的方式使得大鼠系膜細(xì)胞內(nèi)TIMP-1的表達(dá)量降低，以期在后續(xù)實驗中可進(jìn)一步達(dá)到體外治療的效果。在此基礎(chǔ)上，我們設(shè)計了3種不同的siRNA序列，并對它們的沉默效應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，這3種siRNA序列均有效抑制TIMP-1在大鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá)，并且第一條siRNA序列siTIMP1-1效果最佳。在未來的研究工作中，我們可以利用該siRNA進(jìn)行動物體內(nèi)治療試驗，這一工作將為抑制腎炎癥反應(yīng)、減少腎ECM聚集、釋放MMPs降解功能、阻止甚至逆轉(zhuǎn)腎纖維化進(jìn)程、改善腎結(jié)構(gòu)及功能打下基礎(chǔ)。也為進(jìn)一步研究siRNA的作用，探索TIMP-1對炎癥作用和腎纖維化的影響，尋求預(yù)防和治療腎疾病的有效措施奠定了實驗基礎(chǔ)。

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