吳石平，陳 文，劉作易

（1．貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025；2．貴州省植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng)550006；

3．貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550006）

葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）是葡萄座腔菌目中最重要的幾個(gè)屬之一，廣泛分布于世界各地，常寄生或腐生于多種植物或有機(jī)基質(zhì)上，是農(nóng)作物、林木、經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物上的重要病原菌［1－4］。有的葉點(diǎn)霉屬存在于植物體內(nèi)，為植物的重要內(nèi)生真菌，對(duì)植物的生長(zhǎng)和抗病起著重要的作用，有的還可分泌一些有生物活性的化合物［5－7］。多樣性研究對(duì)新種的發(fā)現(xiàn)、物種的認(rèn)識(shí)、完善生物演化理論、利用有益物種和控制有害物種有著重要意義［8］。由于葉點(diǎn)霉屬真菌的分類爭(zhēng)議較多及系統(tǒng)學(xué)資料缺乏，其多樣性研究未見報(bào)道。因此，筆者以近年已準(zhǔn)確分類且有明確寄主、采集國(guó)家及序列數(shù)據(jù)的菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行寄主的多樣性及地理分布研究，以期為今后新種的發(fā)掘和鑒定、有益內(nèi)生真菌的利用及其與寄主（宿主）植物的協(xié)同進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 菌株

從近年發(fā)表的葉點(diǎn)霉屬真菌分類及鑒定文章［9－30］中篩選分類信息準(zhǔn)確的菌株共67種203株（表1），其中，53株為模式（type）或外模（epi－type）菌株，提取這些菌株的基因序列獲取號(hào)，從Gene－Bank下載ITS、ACT、TEF－1 和GPDH 基因序列，同時(shí)提取這些菌株的寄主信息及地點(diǎn)（國(guó)家）。

1．2 系統(tǒng)學(xué)分析

采用 在線比對(duì)軟件MAFFT（http：／／www．ebi．a(chǎn)c．uk／Tools／msa／mafft）對(duì)篩選的基因序列進(jìn)行比對(duì)；在BioEdit（1．7．3．0）中打開已完成比對(duì)的序列進(jìn)行手工校正，并將序列兩端剪切整齊，將4個(gè)基因的序列進(jìn)行連接；用Gblocks對(duì)保守區(qū)序列進(jìn)行選擇，用PAUP（v4．0）軟件進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法（MP）重建系統(tǒng)樹，并進(jìn)行自展檢驗(yàn)，將自展檢驗(yàn)值標(biāo)記在系統(tǒng)樹的分枝上。

1．3 多樣性分析

采用Shannon指數(shù)（H）和Simpson指數(shù)（D）［31］分析內(nèi)生真菌的群落生物多樣性。

2 結(jié)果與分析

2．1 系統(tǒng)發(fā)育

6 7種的ITS、ACT、EF和GAPDH 基因聯(lián)合

表1 67種203株葉點(diǎn)霉屬真菌菌株Table 1 203 Phyllostictafungus strains of 67species

后，序列總的位點(diǎn)數(shù)為1 751個(gè)，其中，保守位點(diǎn)為912個(gè)，無簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)238個(gè)，最大簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)601個(gè)（占總位點(diǎn)數(shù)的34．8%），采用最大簡(jiǎn)約法分析得到48棵系統(tǒng)樹，經(jīng)Kishino－Hasegawa檢驗(yàn)，各個(gè)系統(tǒng)樹之間無顯著差異。系統(tǒng)發(fā)育樹的樹長(zhǎng)為3 245，一致性指數(shù)（CI）為0．418，同型指數(shù)（HI）為0．582，保留指數(shù)（RI）為0．643，重標(biāo)定指數(shù)（RC）為0．268。根據(jù)自展支持率、支系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、支系包含的物種數(shù)量等信息將系統(tǒng)樹分為9個(gè)支系（圖示）。

圖示 葉點(diǎn)霉屬真菌的系統(tǒng)樹及寄主多樣性Fig． Phylogenetic tree and host diversity of Phyllostictafungus

2．2 寄主（宿主）的多樣性

經(jīng)專化性分析（表2），葉點(diǎn)霉屬寄主范圍較廣，在蕨類植物、裸子植物和被子植物上均有分布。67種菌株的寄主分屬32目45科；在蕓香目、百合目、杜鵑花目、囊荷目、無患子目、微子目和鼠李目等7個(gè)目中分離到的菌株較多，共140個(gè)，占69．0%。7個(gè)目中，百合目上真菌的多樣性較多，其上分離的葉點(diǎn)霉屬真菌分屬于5 個(gè)支系，Shannon 指數(shù)為1．357，Simpson指數(shù)為0．732；其余各目中葉點(diǎn)霉屬真菌多樣性較小，其中，鼠李目（葡萄科）、荷囊目（芭蕉科）和無患子目的漆樹科上均只分離到1個(gè)支系的葉點(diǎn)霉真菌。不同種的寄主多樣性不相同（表3），其中，中央葉點(diǎn)霉（P．capitalensis）的寄主范圍最廣，54 個(gè)菌株來源于24 科的植物；芒果球座菌（G．mangiferae）的寄主也較廣，3個(gè)菌株分別來源于3科的植物；大多數(shù)種的寄主范圍較窄，均來源于一個(gè)科，甚至一個(gè)屬，如P．citricarpa 的16個(gè)菌株均分離于蕓香科的柑桔屬，P．vaccinii的16個(gè)菌株均分離于葡萄科。部分親緣關(guān)系較近的種只寄生于一個(gè)科或一個(gè)目的幾個(gè)科，如P．citriasiana、P．citriasiana和P．citriasiana 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，均屬蕓香科；有的葉點(diǎn)霉在系統(tǒng)發(fā)育上屬于較高支持率的同一支系，卻分離于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物，如P．fallopiae和P．a(chǎn)lliacea 分別分離于雙子葉植物的蓼科和單子葉植物的百合科，從葉點(diǎn)霉屬真菌和宿主植物來看，其系統(tǒng)發(fā)育無明顯相關(guān)性（圖示）。

表2 不同寄主（宿主）植物上葉點(diǎn)霉的多樣性Table 2 Diversity of Phyllostictaon different hosts

表3 葉點(diǎn)霉屬真菌葉點(diǎn)霉屬真菌的寄主（宿主）數(shù)量Table 3 Host number of Phyllostictafungi

表4 不同國(guó)家葉點(diǎn)霉屬真菌的多樣性Table 4 Diversity of Phyllostictafungi of different countries

2．3 地理分布的多樣性

從表4看出，67種（203個(gè)菌株）葉點(diǎn)霉屬真菌來源于23個(gè)國(guó)家或地區(qū)。其中，來源于泰國(guó)、美國(guó)、中國(guó)、日本、巴西、澳大利亞和南非等7個(gè)國(guó)家和地區(qū)的菌株較多，共159個(gè)菌株，占78．3%；各個(gè)支系在地理分布上無明顯的偏好性。分離到菌株較多的7個(gè)國(guó)家中，美國(guó)的多樣性最高，34個(gè)菌株分屬于7個(gè)支系，shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別為1．418和0．722；其次為中國(guó)和日本；泰國(guó)多樣性最低，38個(gè)菌株分屬于2個(gè)支系，且C1支系占了92．1%；shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別為0．642和0．542。

3 結(jié)論與討論

葡萄座腔菌科真菌由于孢子較小，可用于分類特征較少，所以寄生的部位和寄主常作為分類的輔助依據(jù)，如從銀杏葉部分離到的葡萄座腔菌就為銀杏葉點(diǎn)霉，胡桃科植物葉片上分離到的葡萄座腔菌就為胡桃葉點(diǎn)霉［32－33］。因此，葡萄座腔菌科內(nèi)屬間分類長(zhǎng)期以來較為混亂［34］，在葉點(diǎn)霉屬的屬內(nèi)種間分類也存在較多的爭(zhēng)議。筆者從系統(tǒng)學(xué)的角度分析了葉點(diǎn)霉屬的寄主多樣性，證實(shí)了大多數(shù)葉點(diǎn)霉屬真菌在種內(nèi)存在寄主的特異性，部分親緣關(guān)系較近的種也存在寄主的特異性，僅寄生于一個(gè)科或一個(gè)目的幾個(gè)科，但整個(gè)葉點(diǎn)霉屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與寄主的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并無明顯相關(guān)性；一個(gè)科的寄主植物上常寄生（內(nèi)生）多種葉點(diǎn)霉屬真菌，因此，以寄主植物來作為分類的輔助依據(jù)，有一定的弊端。

共選擇67 種，203個(gè)菌株進(jìn)行研究，這些種在地域分布上無明顯的偏好性，但有的國(guó)家分離到的葉點(diǎn)霉種類較多，菌種多樣性較高，有的國(guó)家分離到的種類較少，多樣性較低，這有可能與葉點(diǎn)霉屬真菌在與寄主（宿主）協(xié)同進(jìn)化過程中的寄主植物廣泛分布有關(guān)。具體原因有待于聯(lián)合種內(nèi)和種間的數(shù)據(jù)進(jìn)一步的試驗(yàn)和分析。

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