李璟等

摘 要 觀察多級氧濃度對體外培養(yǎng)條件下小鼠原代骨髓基質細胞、小鼠3T3-L1前脂細胞及大鼠BRL肝細胞生長的影響，探究不同類型細胞體外增殖的最佳O2體積分數(shù)以及對低氧和高氧耐受力的差異.實驗結果顯示，在10%～18%O2范圍內骨髓基質細胞增殖最快、活力最強，而3T3-L1前脂細胞及BRL肝細胞生長的最適O2體積分數(shù)為5%.O2濃度過低嚴重損害這幾種細胞在培養(yǎng)下的生存能力，O2濃度過高有致死性毒性作用.這些結果表明，原代與長期傳代細胞最佳生長的適宜氧濃度有一定的差異，對低氧和高氧的耐受力也強弱不同.

關鍵詞 氧濃度；細胞培養(yǎng)；增殖；細胞活力

中圖分類號 Q256 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2014）06-0013-06

Abstract The effects of various oxygen concentrations on population growth of mouse bone-marrow primary stromal cells， murine 3T3-L1 preadipocytes and rat BRL hepatocytes during the 48 h-culture period were examined in order to explore the optimal oxygen concentration and difference in tolerance limits to hypoxia and hyperoxia for cell proliferation in vitro. The results show that the primary stromal cells had the highest proliferative activity and greatest viability at oxygen concentrations of 10% and 18%， while 3T3-L1 preadipocytes and rat BRL hepatocytes did at oxygen concentration of 5%. Too low oxygen greatly impaired survival of these cell types， and too high oxygen exerted lethal toxicity on them. These data suggest that the primary cells and the immortal cell lines require different concentrations of oxygen for their optimal growth， and they have different tolerance limits to hypoxia and hyperoxia as well.

Key words oxygen concentration； cell culture； proliferation； cell viability

氧是細胞生存的必要條件之一，也是細胞生物學行為和生理功能的一種重要調節(jié)因子[1-2].細胞在體外培養(yǎng)下的生存和生長也必須有適宜的氧濃度，細胞培養(yǎng)本身又是研究氧生物學作用的重要方法.然而，多種細胞體外培養(yǎng)所需的最適氧濃度還不確定，不同氧濃度對細胞的作用及其機制尚不完全清楚.細胞的類型和機能狀態(tài)、技術條件等因素都可影響細胞對氧濃度變化的反應[3-5].本文利用作者所在實驗室建立的細胞體外培養(yǎng)的一種新方法，研究不同氧濃度對幾種原代和傳代細胞生長的影響，為體外細胞培養(yǎng)最適氧體積分數(shù)的選擇和與氧相關細胞病理及生理的深入研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞系

昆明種小鼠，雌雄不限，4周齡，體重18～22 g，購于中南大學實驗動物學部；小鼠前脂細胞3T3-L1系和大鼠肝細胞BRL系分別由本院心臟發(fā)育研究室和衰老生物化學研究室惠贈.

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen-Gibco公司產品，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和胰蛋白酶（typsin）為Sigma產品.

13 方法

1.3.1 骨髓基質細胞的原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下分離出股骨和脛骨，用DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓.依次用6、5、4號針頭吸打沖出的骨髓，制成單細胞懸液，作有核細胞計數(shù).骨髓有核細胞于20%（體積分數(shù)）FBS的DMEM培養(yǎng)液中，以1×107/mL的細胞密度種入12.5 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng).48h后吸出上懸液中未貼壁細胞，將貼壁細胞用于不同氧濃度條件下的培養(yǎng)實驗.

1.3.2 MSC集落形成實驗 取上述小鼠骨髓單細胞懸液，調有核細胞密度為2×106/mL，接種于12.5 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL，培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境條件同前.48 h后換液，采用本研究室所創(chuàng)培養(yǎng)器皿內定量混配氣體的抽氣-注氣法（專利申報中），在培養(yǎng)瓶中配制不同體積分數(shù)的6組混合氣體：1%O2、5%O2、10%O2、18%O2（標準CO2培養(yǎng)箱內O2體積分數(shù)）、30%O2、95%O2組.細胞培養(yǎng)至第9天，Wright-Giemsa 染色.光鏡下計數(shù)間充質干細胞（mesenchymal stem cell， MSC）集落個數(shù)（≥10個成纖維樣細胞的聚合計為1個集落），點析分法測算平均集落面積.

1.3.3 小鼠3T3-L1細胞系和大鼠BRL肝細胞系的傳代培養(yǎng) 將凍存于液氮的3T3-L1細胞和BRL肝細胞復蘇，種入12.5 cm2培養(yǎng)瓶，在上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，每3 d換液，細胞貼壁生長接近融合狀態(tài)時，用胰蛋白酶消化法作分瓶傳代.獲得足夠細胞時，取60%左右融合狀態(tài)的細胞，做不同氧濃度條件下的培養(yǎng)實驗.

1.3.4 不同氧濃度培養(yǎng)條件下的細胞培養(yǎng) 將上述骨髓基質細胞、3T3-L1細胞和BRL肝細胞分為6個組進行培養(yǎng)，各組氣相培養(yǎng)環(huán)境的CO2體積分數(shù)、培養(yǎng)基和溫度同前.

1.3.5 骨髓基質細胞培養(yǎng)中實時觀察和拍照 在骨髓基質細胞受不同氧濃度處理前（0 h）和處理后12、24、48 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)并拍照.

1.3.6 細胞計數(shù) 各組細胞培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化法收獲貼壁細胞，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，算出每培養(yǎng)瓶的細胞總數(shù).

1.3.7 MTT比色法 用胰蛋白酶消化法收取培養(yǎng)48 h的各氧濃度組細胞，每一12.5 cm2培養(yǎng)瓶均收獲2 mL細胞懸液，將細胞懸液加入96孔板，0.5 mL/孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL孵育4 h，吸棄懸液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），避光輕輕振蕩15 min.用酶聯(lián)免疫檢測儀測取各孔的490 nm吸光值.

1.3.8 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據均以平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05.用SPSS 13.0軟件做統(tǒng)計分析，SigmaPlot軟件作圖.

2 結果

2.1 不同氧體積分數(shù)下骨髓基質細胞的形態(tài)學變化

各組小鼠骨髓基質細胞在48 h培養(yǎng)過程中的形態(tài)學變化如圖1所示.18%O2組細胞貼壁生長狀態(tài)最好，細胞伸展較長較寬，胞體明亮；隨時間延長，細胞數(shù)量增加.在O2體積分數(shù)小于18%的3個組，細胞形態(tài)與18%O2組基本相同，但隨氧濃度降低和培養(yǎng)時間延長，細胞伸展的長度和寬度略為變小，細胞亮度漸見減低.10%O2組細胞數(shù)量逐漸增加，但增速略小于18%O2組；5%O2和1%O2組的細胞數(shù)逐漸減少，且1%O2組的細胞數(shù)目減少較快.在O2體積分數(shù)大于18%的兩個組中，30%O2組細胞形態(tài)的變化與小于18%O2組相似，細胞數(shù)量漸見減少；而95%O2組細胞隨培養(yǎng)時間延長較快地變圓，數(shù)量快速減少，培養(yǎng)至24 h，只觀察到少數(shù)細胞沉于瓶底及漂浮在懸液中，至48 h，視野中的細胞所剩無幾.

2.2 不同氧體積分數(shù)對骨髓基質細胞體外增殖和活力的影響

注：柱上方的連線表示18%O2組與其余各組之間的差異有統(tǒng)計學顯著性；柱上方標記相同字母表示對應兩組間的差異有統(tǒng)計學顯著性，下同.

各組小鼠骨髓基質細胞在培養(yǎng)48 h后，18%O2組細胞計數(shù)最多、MTT試驗吸光值最高.與18%O2組比，10%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗吸光值無明顯差異.5%O2和1%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗吸光值均顯著低于18%O2組和10%O2組；1%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗指標比5%O2組更低，兩組之間的差異也有顯著性意義.與18%O2組或10%O2組比，30%O2和95%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗吸光值都顯著減低，95%O2組減低程度更大，30%O2組與95%O2組之間的差異也有顯著性（圖2）.

2.3 不同氧體積分數(shù)對MSC集落形成的影響

如表1、圖3所示，18%O2組的小鼠骨髓MSC集落形成率高于其余組，而10%O2組的MSC平均集落面積高于其余組；18%O2組與10%O2組之間，這兩項實驗指標無明顯差異.與18%O2組或10%O2組比，5%O2組和1%O2組的集落形成率均顯著減低，1%O2組的集落形成率還顯著低于5%O2組；O2體積分數(shù)低于10%后，平均集落面積隨O2體積分數(shù)降低而減小，但無統(tǒng)計學顯著性.30%O2組的集落形成率顯著低于18%O2組或10%O2組；平均集落面積也減小，但沒有顯著性意義.95%O2組無集落生成.

2.4 不同氧體積分數(shù)對3T3-L1細胞體外增殖和活力的影響

培養(yǎng)48 h后，5%O2組的3T3-L1細胞計數(shù)最多、MTT試驗吸光值最高.其余各組與5%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗吸光值差異均有顯著性.在10%、18%、30%和95%組，隨O2體積分數(shù)遞增，3T3-L1細胞數(shù)遞減，兩兩組間差異均有顯著性意義；MTT試驗吸光值也隨O2體積分數(shù)遞增而遞減，10%O2組與30%O2組、30%O2組與95%O2組、95%O2組與其余3組之間的差異具有顯著性（圖4）.

2.5 不同氧體積分數(shù)對大鼠BRL肝細胞體外增殖和活力的影響

培養(yǎng)48 h后，各組BRL肝細胞增殖和活力狀況與3T3-L1細胞相似，5%O2組的細胞計數(shù)和MTT試驗吸光值高于其余各組；與5%O2組比，除1%O2組細胞數(shù)的減少無統(tǒng)計學意義外，其余指標的差異均有顯著性.在10%、18%、30%和95%O2組，BRL肝細胞的計數(shù)值和MTT試驗吸光值都隨O2體積分數(shù)遞增而遞減，95%O2組與其余3組之間的細胞數(shù)差異具有顯著性，兩兩組間的MTT試驗吸光值差異均有顯著性意義（圖5）.

3 討論

人和哺乳動物細胞體外培養(yǎng)的氣相環(huán)境條件一般是恒溫37 ℃，含5%～10%CO2及飽和水蒸汽的空氣[6].在細胞培養(yǎng)實驗領域，人們普遍將標準CO2培養(yǎng)箱內空氣的O2體積分數(shù)作為細胞培養(yǎng)氣相環(huán)境的正?；虺Ｒ?guī)氧體積分數(shù)，簡稱常氧（normoxia）.低于和高于常氧的氧濃度分別稱為低氧（hypoxia）和高氧（hyperoxia）[2].氧條件變化對培養(yǎng)細胞的影響已有大量研究，其中主要是低氧研究.由于現(xiàn)有技術條件及費用的限制，實驗中設置的氧條件往往較少，很少在同一培養(yǎng)實驗中研究低氧和高氧對細胞的影響[7].本工作應用所在研究室所創(chuàng)培養(yǎng)器皿內建立氣相條件的新方法，觀察多個氧條件對不同類型細胞體外增殖的影響.其中，18%O2為培養(yǎng)箱內溫度37 ℃、CO2體積分數(shù)5%條件下的氧體積分數(shù)（本實驗所用CO2培養(yǎng)箱為Forma 3110型，氧傳感器實測O2體積分數(shù)顯示（17.6±5）%）.需要說明的是，很多文獻稱標準CO2培養(yǎng)箱內的氧體積分數(shù)是21%，或認為是19.95%；前者即空氣中的氧體積分數(shù)，后者是考慮到培養(yǎng)箱氣相空間內CO2占了5%的體積.但后者還忽略了培養(yǎng)箱內的飽和水蒸汽，如37 ℃的一個大氣壓氣相空間，飽和水蒸汽的體積分數(shù)約為6%.因此，在普通CO2培養(yǎng)箱內溫度為37 ℃、CO2為5%的條件下，較精確的O2體積分數(shù)為187%，或約為18%[8].

近年來，人們對細胞培養(yǎng)的“常氧”提出了疑問，因為在這種條件下細胞周圍培養(yǎng)基的氧條件與正常組織中不符.平均而言，正常人體和哺乳動物組織中的氧體積分數(shù)約為5%（PO2 40 mmHg），遠低于常氧培養(yǎng)條件下細胞周圍的氧濃度.而且，組織中不同區(qū)間或不同類型細胞微環(huán)境的氧條件又有差異.例如骨髓內干細胞微環(huán)境的氧體積分數(shù)測定值，在間充質干細胞壁龕中為2%～8%，在造血干細胞壁龕中為1%～6%[2].由此可知，在機體生理穩(wěn)態(tài)下不同類型細胞具有自身微環(huán)境的氧條件.有人新造了生理氧（physioxia）這一術語，以區(qū)別于常氧.掌握體外培養(yǎng)下各種細胞相應的最適氧條件，對細胞培養(yǎng)技術、氧相關細胞生理和病理的研究都至關重要.

本實驗選擇小鼠骨髓基質細胞（MSCs）、小鼠3T3-L1前脂細胞及大鼠BRL肝細胞為受試對象，除了用原代細胞和長期傳代細胞作比較研究之外，還考慮了在組織內骨髓基質細胞一般處于分裂休止或停滯狀態(tài)下耗氧率較低； 3T3-L1細胞與骨髓基質細胞同屬間充質譜系；肝細胞的代謝活躍，耗氧率較高[9].實驗結果顯示，這幾種細胞最佳生長的適宜氧體積分數(shù)有明顯差異.在10%～18%O2下，骨髓基質細胞的活力最強、增殖最快；而對于3T3-L1細胞系及大鼠BRL肝細胞系，生長的最適氧條件為5%.當氧條件顯著低于或高于各種細胞相應的最適水平時，細胞的生長乃至存活受到不利的影響.

低氧培養(yǎng)對本實驗所用幾種細胞的影響已有一些研究.徐承熊等[10]較早報道在5%O2下小鼠骨髓基質集落形成細胞（CFU-F）形成率顯著增高.最近，Berniakovich等[11]的研究顯示，3%O2促進小鼠骨髓基質細胞的體外增殖和集落形成.此外，Valorani等[12]在2%O2條件下培養(yǎng)小鼠脂肪組織MSCs，觀察到增殖速率高于常氧條件.而且，不少研究者報道低氧有利于人骨髓MSCs的生長，也有研究顯示低氧對大鼠、綿羊、家兔MSCs具有促增殖作用[13-14].然而，有兩個研究組分別報告，低氧通過影響細胞周期運行而抑制人MSCs的體外增殖[15-16].近來，Chung等[17]的實驗結果表明，在5%和1%O2的培養(yǎng)條件下，狗骨髓和脂肪組織MSCs的增殖都受到負性影響.至今，尚未見低氧培養(yǎng)抑制小鼠MSCs生長的研究報道.本研究的培養(yǎng)實時觀察、細胞計數(shù)、MTT比色測定和MSC集落形成實驗結果表明，在≤5%O2的培養(yǎng)條件下，小鼠骨髓基質細胞的增殖抑制.低氧對細胞生長的影響有不一致的實驗結果，與多種因素有關，細胞本身的差異可能是重要的原因.本研究的結果表明，與5%O2培養(yǎng)條件相比，3T3-L1前脂細胞及BRL肝細胞在1%O2條件下的細胞活力減低和增殖抑制.與這一結果不同，Macfarlane等[18]的實驗顯示，3T3-L1細胞系在5%O2培養(yǎng)條件下即發(fā)生生長抑制.Yin等[19]則報告1%O2培養(yǎng)導致3T3-L1細胞壞死和凋亡.關于培養(yǎng)體系中氧濃度降低對肝細胞活力和生長的影響，不同實驗室的研究結果也不一致[20-21].

高氧對本實驗所用幾種細胞影響的研究報道甚少.據迄今為止的文獻檢索，尚無骨髓基質細胞在高氧下培養(yǎng)的研究，一個密切相關的動物實驗是Gomez等[22]將2月齡雌性小鼠暴露于高壓氧（2.8 atm）或常壓純氧，每天90 min，連續(xù)5 d之后，骨髓CFU-F形成率顯著高于對照組.關于高氧培養(yǎng)對肝細胞存活和生長的影響，幾個研究組分別報道了正性或負性結果[23-24].不過，在這幾組實驗中，高氧水平、壓強和處理時間等實驗條件不盡相同.這些因素與細胞高氧暴露效應差異的相關性也見于其他類型細胞的培養(yǎng)研究[25].目前，還未見高氧對3T3-L1前脂細胞影響的研究報道.在本研究中，小鼠骨髓基質細胞在30%O2條件下培養(yǎng)48 h后大量死亡，95%O2下培養(yǎng)48 h后幾乎無細胞存活；肝細胞系BRL和前脂細胞系3T3-L1在10%～ 95%O2條件下培養(yǎng)48 h后，細胞數(shù)隨氧濃度增加而不斷減少.這與以往多種細胞的高氧培養(yǎng)研究結果一致，過高濃度氧的長時間暴露對細胞具有嚴重的損害和毒性作用.

參考文獻：

[1] CARREAU A， EL HAFNY-RAHBI B， MATEJUK A， et al. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter？ Small molecules and hypoxia[J]. J Cell Mol Med， 2011，15（6）：1239-1253.

[2] MOHYELDIN A， GARZN-MUVDI T， QUIONES-HINOJOSA A. Oxygen in stem cell biology： a critical component of the stem cell niche[J]. Cell Stem Cell， 2010，7（2）：150-161.

[3] SALLER M M， PRALL W C， DOCHEVA D， et al. Increased stemness and migration of human mesenchymal stem cells in hypoxia is associated with altered integrin expression[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2012，423（2）：379-385.

[4] KARLSEN T A， MIRTAHERI P， SHAHDADFAR A， et al. Effect of three-dimensional culture and incubator gas concentration on phenotype and differentiation capability of human mesenchymal stem cells[J]. J Cell Biochem， 2011，112（2）：684-693.

[5] OLIVEIRA P H， BOURA J S， ABECASIS M M， et al. Impact of hypoxia and long-term cultivation on the genomic stability and mitochondrial performance of ex vivo expanded human stem/stromal cells[J]. Stem Cell Res， 2012，9（3）：225-236.

[6] 王芳妹，楊子劍，韓 梅，等.阿司匹林對人慢性粒細胞白血病細胞株K562的生長抑制作用[J].湖南師范大學自然科學學報， 2013，36（5）：75-80.

[7] NISHIKAWA M， UCHINO J， MATSUSHITA M， et al. Optimal oxygen tension conditions for functioning cultured hepatocytes in vitro[J]. Artif Organs， 1996，20（2）：169-177.

[8] MATHER J P， ROBERTS P E. Introduction to cell and tissue culture： theory and technique[M]. New York： Plenum Press， 1998.

[9] BALIS U J， BEHNIA K， AWARAKANATH B， et al. Oxygen consumption characteristics of porcine hepatocytes[J]. Metab Eng， 1999，1（1）：49-62.

[10] 徐承熊，韓 銳. 培養(yǎng)條件對小鼠骨髓基質集落形成細胞在體外生長的影響[J]. 中國醫(yī)學科學院學報， 1990，12（4）：257-261.

[11] BERNIAKOVICH I， GIORGIO M. Low oxygen tension maintains multipotency， whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells[J]. Int J Mol Sci， 2013，14（1）：2119-2134.

[12] VALORANI M G， GERMANI A， OTTO W R， et al. Hypoxia increases Sca-1/CD44 co-expression in murine mesenchymal stem cells and enhances their adipogenic differentiation potential[J]. Cell Tissue Res， 2010，341（1）：111-120.

[13] HUNG S P， HO J H， SHIH Y R， et al. Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potentials of human mesenchymal stem cells[J]. J Orthop Res， 2012，30（2）：260-266.

[14] FU W L， JIA Z Q， WANG W P， et al. Proliferation and apoptosis property of mesenchymal stem cells derived from peripheral blood under the culture conditions of hypoxia and serum deprivation[J]. Chin Med J （Engl）， 2011，124（23）：3959-3967.

[15] ZENG H L， ZHONG Q， QIN Y L， et al. Hypoxia-mimetic agents inhibit proliferation and alter the morphology of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells[J]. BMC Cell Biol， 2011，12：32.

[16] HOLZWARTH C， VAEGLER M， GIESEKE F， et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells[J]. BMC Cell Biol， 2010，11：11.

[17] CHUNG D J， HAYASHI K， TOUPADAKIS C A， et al. Osteogenic proliferation and differentiation of canine bone marrow and adipose tissue derived mesenchymal stromal cells and the influence of hypoxia[J]. Res Vet Sci， 2012，92（1）：66-75.

[18] MACFARLANE C M. In vitro influence of sublethal hypoxia on differentiation of the 3T3-L1 preadipose cell line and its physiological implications[J]. Life Sci， 1997，60（21）：1923-1931.

[19] YIN J， GAO Z， HE Q， et al. Role of hypoxia in obesity-induced disorders of glucose and lipid metabolism in adipose tissue[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2009，296（2）：E333-342.

[20] LILLEGARD J B， FISHER J E， NEDREDAL G， et al. Normal atmospheric oxygen tension and the use of antioxidants improve hepatocyte spheroid viability and function[J]. J Cell Physiol， 2011，226（11）：2987-2996.

[21] SULEIMAN S A， STEVENS J B. The effect of oxygen tension on rat hepatocytes in short-term culture[J]. In Vitro Cell Dev Biol， 1987，23（5）：332-338.

[22] GOMEZ C R， KNUTSON G J， CLIFTON K B， et al. Age-dependent response of murine female bone marrow cells to hyperbaric oxygen[J]. Biogerontology， 2012，13（3）：287-297.

[23] FARISS M W. Oxygen toxicity： unique cytoprotective properties of vitamin E succinate in hepatocytes[J]. Free Radic Biol Med， 1990，9（4）：333-343.

[24] MIZUGUCHI T， OSHIMA H， IMAIZUMI H， et al. Hyperbaric oxygen stimulates cell proliferation and normalizes multidrug resistance protein-2 protein localization in primary rat hepatocytes[J]. Wound Repair Regen， 2005，13（6）：551-557.

[25] CONCONI M T， BAIBUERA S， GUIDOLIN D， et al. Effects of hyperbaric oxygen on proliferative and apoptotic activities and reactive oxygen species generation in mouse fibroblast 3T3/J2 cell line[J]. J Investig Med， 2003，51（4）：227-232.

（編輯 王 ?。?