任麗民，張莉蕓，張改連，許　珂，高晉芳

(山西醫(yī)科大學附屬大醫(yī)院風濕免疫科，太原 030001)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，確切發(fā)病機制不明?；静±砀淖?yōu)榛ぱ?、血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關節(jié)軟骨和骨破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，目前常用于血液系統(tǒng)疾病的臨床治療。近年實驗發(fā)現(xiàn)，ATO對RA發(fā)病過程中的關鍵因素如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、核轉錄因子Kappa B(nuclear factor Kappa B，NF-κB)的表達有調控作用，通過降低TNF-α表達水平、抑制血管新生、促進成纖維樣滑膜細胞的凋亡抑制其增生來達到治療RA的效果[1]。但其對RA發(fā)病過程中趨化因子有無影響以及其作用機制，目前尚不清楚。本研究將通過評估ATO對膠原誘導關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠關節(jié)癥狀的改善程度及觀察其對CIA大鼠血清炎性因子的影響探討其可能作用機制。

材料和方法

實驗動物

28只Witar大鼠：清潔級，雌性，體重(160±20) g，購自山西醫(yī)科大學動物研究中心，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學動物房，空調控制室溫20℃左右，相對濕度50%，飼養(yǎng)過程中自由攝食及水。

主要試劑和儀器

材料：ATO注射液10mg購于伊達公司；天然牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購于Sigma公司(U.S.A)。Aimplex?Rat Custom 9-plex kit購于北京曠博生物技術有限公司。

儀器：流式細胞儀(NovoCyte D1040型，艾森生物有限公司)。

CIA模型的建立

牛Ⅱ型膠原5 mg溶于2.5 ml 0.01 mol/L pH 3.2的冰醋酸溶液中，4℃冰箱過夜；與25 ml完全弗氏佐劑反復乳化，制成含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液。分別給予準備造模的Wistar大鼠5個點(背部3個點、尾根部及任一后足掌各1個點)皮內注射乳化液，每點0.1 ml，共0.5 ml。正常組大鼠體內注射等量的生理鹽水。第14天，給予每只大鼠用含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液腹腔注射0.2 ml加強免疫，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[2]。

實驗分組及實驗方法

動物準備：給藥前實驗鼠苦味酸標記常規(guī)分組。A組：空白對照組8只；B組：CIA模型對照組8只；C組：ATO治療組8只。

實驗方法：造模第14天后，在20只Wistar大鼠中選擇關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)>7分且雙后踝關節(jié)X線評分≥Ⅲ級改變的大鼠16只，將其完全隨機分為2組，分組進行觀察。另選取8只正常鼠作為對照組，分籠飼養(yǎng)。ATO治療組在分組3 d后腹腔注射ATO液1周，劑量4 mg/kg，最后l d給予8 mg/kg，觀察3 d取材[3]，歷時27 d。對照組以同樣方法給予等容量的生理鹽水。

關節(jié)炎指數(shù)評定

AI分為0～4分。0分：無關節(jié)炎癥(無紅腫)；1分：有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節(jié)中度腫脹；3分：關節(jié)重度腫脹；4分：關節(jié)僵直甚至畸形，嚴重功能障礙[4]。

主要觀察后足踝關節(jié)，初次免疫前觀察1次，初次免疫后急性期前6周每3天觀察1次，此后慢性期每周觀察1次。

雙后肢足腫脹度測量

用容積法(排水法)測量雙后肢的足腫脹度。測量方法：用帶刻度的10 ml小試管裝適量水，請助手固定大鼠，將待測后肢(包括整個足掌)，以脛骨下端內踩處為解剖標志點，深入液面下，觀察并記錄水面上升數(shù)值。測量時點為：初次免疫前測量1次，初次免疫之后每周測量1次。

關節(jié)破壞情況觀察

給予大鼠四肢關節(jié)行X線檢查，觀察關節(jié)破壞情況。每次檢查前，對被測大鼠進行麻醉，每只大鼠予5%水合氯醛5 ml/kg，腹腔注射，約過5 min左右，接受麻醉大鼠肌張力消失，結膜反射消失，仰臥位于解剖板，將四肢伸展固定，通常用醫(yī)用膠布固定，置于X射線機下，在一定放射條件下，留取影像學X線資料。于在初次免疫前、初次免疫后2周(造模成功)、初次免疫后27 d(ATO液干預后)留取大鼠關節(jié)影像學資料，由兩位有經驗的放射學醫(yī)師結合大鼠關節(jié)表現(xiàn)及AI分別對檢查結果進行分析，并作出定量評分，同時進行動態(tài)觀察和組間比較。

影像學破壞分級標準：Ⅰ級：無破壞性改變，可見骨質疏松；Ⅱ級：骨質疏松，可有輕度的軟骨破壞，有或沒有輕度的軟骨下骨質破壞，可見關節(jié)間隙狹窄，但無關節(jié)畸形；Ⅲ級：骨質疏松加軟骨或骨質破壞，關節(jié)畸形，如半脫位、尺側偏斜，無纖維性或骨性強直；Ⅳ級：纖維性或骨性強直。

趨化因子檢測方法

干預后麻醉動物，內眥靜脈取血2 ml，以2 500 r/min離心15 min，取血清，置于-20℃?zhèn)錂z。流式多因子檢測技術檢測血清正常T細胞表達分泌的活性調節(jié)蛋白(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)、單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic factor，MCP)-1、干擾素γ誘導蛋白10(interferon gamma induced protein 10，IP-10)濃度，操作按照Aimplex?Rat Custom 9-plex試劑盒說明書進行，按1∶3進行稀釋，由FCAP Array軟件(V3.0)分析。

統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，應用兩樣本t檢驗進行組間比較；不滿足正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)來表示，組間比較應用Kruskl-Wallis秩和檢驗進行。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

一般情況

造模組大鼠飲食、活動減少，體重增長緩慢，精神倦怠，毛發(fā)無光澤；部分大鼠于初次免疫1周后后肢足趾關節(jié)開始出現(xiàn)紅腫瘀斑，并逐漸加重。藥物治療后精神狀態(tài)逐漸好轉、關節(jié)腫脹有不同程度減輕?？瞻讓φ战M未見上述癥狀。

關節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度及X線檢查

腹腔注射ATO液1周后大鼠關節(jié)炎指數(shù)、雙后足足腫脹度較同期CIA模型組明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(表1、圖1)。X線檢查示，空白對照組關節(jié)無破壞，為Ⅰ級改變；CIA模型對照組在造模第14天時關節(jié)破壞均達到Ⅲ級改變，27 d后有6只達到Ⅳ級改變，2只為Ⅲ級改變；ATO治療組在造模第14天時關節(jié)破壞均達到Ⅲ級改變，27 d后有4只為Ⅰ級改變，4只為Ⅱ級改變，腹腔注射ATO液后關節(jié)破壞程度減輕(圖2)。

血清趨化因子水平比較

CIA模型對照組血清RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ATO治療組與CIA模型對照組相比上述因子均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2、圖3)。

表1三氧化二砷對膠原誘導關節(jié)炎大鼠關節(jié)癥狀改善程度(27 d)

分組足腫脹度(ml)關節(jié)炎指數(shù)空白對照組(n=8)4 11±0 140 41±0 11膠原誘導關節(jié)炎模型對照組(n=8)8 12±0 15?6 62±0 91#三氧化二砷治療組(n=8)5 13±0 102 63±0 92

與三氧化二砷治療組比較，*t=5.21，*P=0.020，#t=8.73，#P=0.000

圖1各組關節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度變化趨勢及組間比較

Fig1Tendency of arthritis index，foot swelling degree of each groups

A：關節(jié)炎指數(shù)；B：足腫脹度

圖2三氧化二砷對膠原誘導關節(jié)炎大鼠關節(jié)影像學X線表現(xiàn)

Fig2Change joint imaging X-ray of CIA rats after inject arsenic trioxide

A：空白對照組大鼠無關節(jié)間隙模糊、破壞；B：初次免疫后2周大鼠，骨質疏松、部分間隙狹窄、模糊，可見關節(jié)畸形；C：膠原誘導關節(jié)炎模型對照組(27 d)，關節(jié)間隙狹窄、模糊，關節(jié)破壞明顯，部分關節(jié)融合；D：三氧化二砷治療組(27 d)，關節(jié)間隙較膠原誘導關節(jié)炎模型對照組清晰，骨小梁較致密，關節(jié)破壞不明顯

表2　各組血清趨化因子水平比較

Table 2　The serum chemokine level of each groups　(pgml)

表2　各組血清趨化因子水平比較

分組正常T細胞表達分泌的活性調節(jié)蛋白單核細胞趨化因子?1干擾素γ誘導蛋白10空白對照組(n=8)5390 24±629 081211 77(532 35，1506 94)31 96±17 50膠原誘導關節(jié)炎模型對照組(n=8)8118 89±2836 1422048 23(6092 53，40457 13)282 48±273 93三氧化二砷治療組(n=8)6134 76±548 152946 08(1749 84，4600 94)41 60±15 86χ210 48622 80710 773P0 0150 0000 013

圖3各組血清趨化因子水平比較

Fig3Serum chemokine level of each groups

A：正常T細胞表達分泌的活性調節(jié)蛋白；B：單核細胞趨化因子-1；C：干擾素γ誘導蛋白10

討　　論

RA是以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，致畸、致殘率高。目前，用于RA治療的藥物主要為激素、免疫抑制劑以及生物制劑，但對于已經發(fā)生畸形的患者上述藥物療效不佳。ATO作為凋亡誘導劑，是治療白血病的常用藥。張志毅等[5]觀察到，急性早幼粒細胞白血病合并RA的患者應用ATO治療后，在白血病緩解的同時，RA的關節(jié)損害癥狀也明顯減輕。國外也有報道，ATO用于治療白血病合并RA的患者，RA的癥狀也得到明顯緩解[6]。

趨化因子是一類可誘導的、分泌型促炎細胞因子，在RA中趨化因子對炎性細胞在關節(jié)局部浸潤過程中具有重要作用，與滑膜炎、軟骨組織破壞及血管新生有密切關系。根據(jù)分子結構中半胱氨酸殘基的位置不同，趨化因子分為C-X-C、C-C、C、C-X3-C 4大超基因家族。其受體相應命名為CXCR、CCR、CR、CX3CR 4個亞家族。在RA患者血清和關節(jié)滑液中有大量趨化因子表達，其中以CCL5/RANTES、CCL3/MIP和CCL2/MCP-1這些CC類趨化因子最為顯著[7-8]。RANTES屬于CC類趨化因子，主要由T淋巴細胞產生，在炎性T淋巴細胞浸潤到關節(jié)過程中起關鍵作用，在RA患者外周血、滑膜細胞、淋巴細胞中均可檢測到高水平的RANTES[9]。動物研究發(fā)現(xiàn)，關節(jié)部位RANTES的表達與關節(jié)炎癥及關節(jié)破壞程度有相關性，經RANTES拮抗劑治療后可減輕關節(jié)炎癥[10]。MCP-1也屬于CC亞家族成員，主要是對單核細胞、T細胞、自然殺傷細胞產生趨化作用[11]。Yao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者滑膜及滑液中MCP-1表達明顯升高。IP-10/CXCL10是CXC類趨化因子之一，干擾素γ和Fas調節(jié)信號刺激單核巨噬細胞和T淋巴細胞產生IP-10，與受體CXCR3結合后可向CD4+Th1細胞方向分化，促進炎癥反應的發(fā)生[13-14]。Kwak等[15]發(fā)現(xiàn)，在CIA小鼠血清中IP-10水平明顯高于對照組，CXCL10可誘導RANKL表達于破骨細胞前體，刺激RANKL、TNF-α表達于CD4+T細胞從而導致骨破壞，提示IP-10有助于炎細胞的招募和參與RA骨侵蝕破壞。

可見，趨化因子是RA發(fā)生發(fā)展過程中重要炎性介質，但是腹腔注射ATO液對RA發(fā)病過程中異常改變的趨化因子有無影響以及具體機制如何，目前尚無報道。本研究通過腹腔注射治療劑量的ATO液來觀察CIA大鼠關節(jié)癥狀的緩解程度，并通過流式多因子檢測技術對CIA大鼠血清中RANTES、MCP-1、IP-10進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，CIA模型組血清中RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于同期空白對照組，說明CIA大鼠體內存在免疫功能紊亂，上述炎性趨化因子表達異常，可能在RA的發(fā)病中起一定作用。經腹腔注射ATO后CIA大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯降低，上述血清趨化因子也顯著低于同期CIA模型對照組，說明ATO改善CIA大鼠的關節(jié)炎癥狀的作用機制可能通過下調趨化因子MCP-1、RANTES、IP-10水平的表達來發(fā)揮作用。

本研究結果雖然證實了腹腔注射ATO液可以下調CIA大鼠血清中的趨化因子的產生，但這種作用效應是直接通過下調趨化因子及其受體蛋白或基因表達還是間接作用于各趨化因子誘導物或分泌細胞來使得血清趨化因子水平降低還需進一步實驗探討。

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