摘要：以釀酒酵母中已經(jīng)報(bào)道的5個(gè)典型PITP序列為基礎(chǔ)，對(duì)炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp比對(duì)以及關(guān)鍵詞搜索，并通過(guò)SMART保守結(jié)構(gòu)域分析，明確該菌含有4個(gè)典型的PITP；同時(shí)，通過(guò)對(duì)上述氨基酸序列進(jìn)行疏水性、細(xì)胞信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析，并與其他物種中15個(gè)同源序列進(jìn)行遺傳關(guān)系比較分析，以期為深入開(kāi)展希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）PITP的功能研究打下理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為進(jìn)一步開(kāi)展其他炭疽菌的研究提供重要的理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)；生物信息學(xué)分析；遺傳關(guān)系；炭疽菌屬

中圖分類(lèi)號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0713-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.055

Bioinformatic Analysis on PITP in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry/Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract： Based on the five typical PITP sequences reported in Saccharomyces cerevisiae Sacc.， to search PITP related protein sequence from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp as well as the use of keywords， four typical PITP were identified by conserved domain analysis in the SMART online. Meanwhile， bioinformatic analysis were made including the hydrophobic， signal peptide， trans-membrane domain structure， sub-cellular location and the secondary structure in four PITP proteins. In addition， the analysis of genetic relationships through comparative four PITPs in C. higginsanum with other species of 15 homologous sequences can provide strong theoretical foundation for the function of PITP， and an important theoretical guidance to clarify the other pathogens in Colletotrichum spp.

Key words： Colletotrichum higginsanum Sacc.； PITP； bioinformatics analysis； genetic relationship； Colletotrichum spp.

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）屬于炭疽菌屬真菌，其可以侵染如菜心、小油菜、結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、大白菜、蘿卜等多種十字花科蔬菜作物而引起炭疽病，是一類(lèi)重要的世界性植物真菌病害，現(xiàn)主要分布于美國(guó)、中國(guó)、日本以及印度等國(guó)[1-3]。在我國(guó)，由該病菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常見(jiàn)和發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一[4]。該病害對(duì)廣東省菜心種植地區(qū)具有重要的影響，不僅降低了菜心的產(chǎn)量，對(duì)菜心的品質(zhì)也產(chǎn)生了較大影響[5，6]。國(guó)內(nèi)外對(duì)該病菌的研究主要集中在生物學(xué)特性、生防菌篩選以及遺傳轉(zhuǎn)化等方面[7，8]，同時(shí)，隨著該病菌基因組序列的釋放[9]，林春花等[10]對(duì)其開(kāi)展了MAPK途徑相關(guān)基因的找尋及信號(hào)通路簡(jiǎn)圖的繪制工作。

磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（Phosphatidylinositol transfer protein，PITP）是一類(lèi)廣泛存在于真核生物細(xì)胞中具有一個(gè)疏水性強(qiáng)的水溶性蛋白質(zhì)載體，其功能在于把一分子的脂類(lèi)物質(zhì)包裹在疏水腔內(nèi)，使包裹的脂類(lèi)物質(zhì)遠(yuǎn)離細(xì)胞質(zhì)內(nèi)水溶性的環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)脂類(lèi)物質(zhì)在不同膜間定向轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。該蛋白質(zhì)通過(guò)參與調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝途徑和胞內(nèi)進(jìn)程，從而在多個(gè)復(fù)雜的生理發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。目前，認(rèn)為在肌醇磷脂代謝途徑中發(fā)揮重要作用的有PITP-PLC（磷脂酶C）途徑、CDP（胞嘧啶核苷二磷酸）-膽堿生物合成途徑[13，14]。學(xué)術(shù)界對(duì)于植物中所含有的PITP有較多報(bào)道，如大豆、日本百脈根、擬南芥以及棉花等，而對(duì)于真菌PITP的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。

本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已經(jīng)報(bào)道的5個(gè)典型PITP氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過(guò)在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp比對(duì)分析以及關(guān)鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母PITP同源的C. higginsanum序列，并通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析、疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析，以期明確該菌中所存在的PITP數(shù)量、疏水性特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征以及細(xì)胞定位情況，同時(shí)，基于上述PITP氨基酸序列，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）在線(xiàn)進(jìn)行同源序列搜索，通過(guò)遺傳關(guān)系分析，以期為進(jìn)一步開(kāi)展其他炭疽菌中PITP的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)釀酒酵母中含有的5個(gè)PITP（Sec14、Pdr16、Pdr17、Sfh5和CSR1）氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)進(jìn)行Blastp比對(duì)[15]，所有參數(shù)均選擇默認(rèn)值，獲得C. higginsianum中所含有的典型PITP，同時(shí)，通過(guò)輸入“Phosphatidylinositol-transfer-protein”、“PITP”關(guān)鍵詞，在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PITP檢索；另外，利用NCBI明確該菌中PITP蛋白質(zhì)登錄號(hào)信息（表1）。

1.2 方法

1.2.1 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用SMART網(wǎng)站在線(xiàn)分析PITP所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。

1.2.2 蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè) 利用Protscale程序[16]對(duì)PITP進(jìn)行疏水性測(cè)定。

1.2.3 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽預(yù)測(cè) 轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)利用TargetP 1.1 Server進(jìn)行在線(xiàn)分析[17]，信號(hào)肽預(yù)測(cè)則是利用SignalP 3.0 Server[18]進(jìn)行在線(xiàn)分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PHD[19]進(jìn)行在線(xiàn)分析。同時(shí)，對(duì)其PITP的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TMHMM Server v. 2.0進(jìn)行在線(xiàn)分析[18]。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 對(duì)C. higginsianum中PITP進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用ProtComp v.9.0進(jìn)行在線(xiàn)分析[20]。

1.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 在NCBI中，以C. higginsianum中所含PITP氨基酸序列為基礎(chǔ)，在線(xiàn)進(jìn)行Blastp同源搜索，獲得來(lái)自不同物種的同源蛋白質(zhì)序列。對(duì)所獲得的同源序列，利用Clustal X軟件[21]進(jìn)行多重比對(duì)分析，隨后利用MEGA 5.2.2軟件[22]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支之間的距離計(jì)算采用p-distance模型，系統(tǒng)可信度檢測(cè)采用自舉法重復(fù)1 000次進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯炭疽菌含有4個(gè)典型的PITP

對(duì)釀酒酵母中典型的5個(gè)PITP進(jìn)行SMART分析，明確上述PITP均具有SEC14保守域結(jié)構(gòu)，除Sfh5外，其他4個(gè)還具有一個(gè)存在于氨基酸序列N端，且尚未知功能的CRAL_TRIO_N保守域結(jié)構(gòu)，同時(shí)，上述典型PITP所含氨基酸的大小范圍為343～469 aa。

對(duì)炭疽菌屬進(jìn)行Blastp比對(duì)分析，除Sec14、CSR1具有同源的序列外，其他3個(gè)（Pdr16、Pdr17、Sfh5）在希金斯炭疽菌中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其同源序列。同時(shí)，結(jié)合關(guān)鍵詞搜索，結(jié)果表明，C. higginsianum中存在4個(gè)與酵母中PITP同源性較高序列，其ID分別為CH063_00815.1、CH063_06673.1、CH063_01014.1、CH063_10638.1。根據(jù)SMART保守域分析，結(jié)果顯示，上述4個(gè)蛋白質(zhì)序列均含有典型PITP所具有的SEC14保守域（圖1），按照氨基酸長(zhǎng)度，重新對(duì)上述希金斯炭疽菌中的典型PITP進(jìn)行命名，分別為ChPITP1、ChPITP2以及ChPITP3、ChPITP4（表1）。

2.2 蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)

疏水性分析結(jié)果顯示，ChPITP1中位于291位的E，親水性最強(qiáng)，數(shù)值達(dá)到-1.995，而位于179位的D，親水性最弱，為0.921；ChPITP2中位于314、317位的Q、W，親水性最強(qiáng)，而位于248位的T，親水性最弱；ChPITP3中位于62位的T，親水性最強(qiáng)，而位于294位的W，親水性最弱；ChPITP4中位于66位的V，親水性最強(qiáng)，而位于255位A，其親水性最弱（表2，圖2）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4這4個(gè)典型PITP盡管在親水性最強(qiáng)氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性氨基酸殘基數(shù)值總和以及親水性氨基酸殘基數(shù)值總和等方面的結(jié)果不盡相同，但均屬于親水性蛋白質(zhì)，這與通過(guò)理化性質(zhì)分析中的GRAVY計(jì)算所得結(jié)果一致。

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽特征

通過(guò)分析，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4具有分泌途徑信號(hào)肽的可能性最大，其預(yù)測(cè)值分別為0.948、0.961、0.854、0.924（表3）。經(jīng)過(guò)SingnalP 3.0 Server在線(xiàn)分析，上述4個(gè)PITP均不含有明顯的信號(hào)肽序列。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)PITP均含有α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，ChPITP1、ChPITP3、ChPITP4所含α螺旋比例較高，分別為49%、51%、46%，而在ChPITP2中，其所含無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占比例較高，為44%；對(duì)于β折疊結(jié)構(gòu)，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4所含比例均較低（圖3）。

通過(guò)TMHMM Server v. 2.0在線(xiàn)分析，上述4個(gè)PITP均不含有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，然而，通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ChPITP4在281到311位氨基酸之間存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩者預(yù)測(cè)不同，有待于今后通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)ProtComp v. 9.0在線(xiàn)分析，結(jié)果表明，4個(gè)典型的PITP亞細(xì)胞定位情況不盡相同，其中，ChPITP1、ChPITP2定位于高爾基體中，而ChPITP3定位于線(xiàn)粒體上，ChPITP4定位于細(xì)胞質(zhì)中（表4）。

2.6 遺傳關(guān)系

在NCBI中，通過(guò)對(duì)C. higginsianum 4個(gè)典型PITP序列進(jìn)行Blastp搜索，分別獲得ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4的同源序列，選擇同源性較高的15條序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，上述4個(gè)PITP與其各自同源序列分別聚在一起，而彼此之間并未聚在一起；就C. higginsianum中每一個(gè)PITP與其他物種同源序列之間的親緣關(guān)系而言，ChPITP1與禾谷炭疽菌中的EFQ27511.1、西瓜炭疽病菌中的ENH76666.1之間親緣關(guān)系較近；ChPITP2與大麗輪枝菌中的EGY17177.1、黑白輪枝菌中的XP003005673.1親緣關(guān)系較近；ChPITP3與C. graminicola中的EFQ29482.1之間的親緣關(guān)系較近；ChPITP4與C. graminicola中的EFQ30498.1之間的親緣關(guān)系較近（圖4），這與前期關(guān)于禾谷炭疽菌PITP的親緣關(guān)系研究所得結(jié)果一致[23]。

3 小結(jié)與討論

C. higginsanum可侵染菜心、白菜等眾多十字花科蔬菜引起炭疽病，不僅影響蔬菜的產(chǎn)量，也對(duì)其品質(zhì)造成重要影響。深入開(kāi)展該病菌的致病因子研究，有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以致病因子為作用靶標(biāo)的防治藥劑。2012年，隨著該菌全基因組序列的釋放[9]，為學(xué)術(shù)界對(duì)其開(kāi)展致病因子研究提供了便利條件。

目前，已經(jīng)明確PITP參與真核生物體內(nèi)眾多生理功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，然而，對(duì)于真菌中PITP的報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究基于釀酒酵母中已經(jīng)報(bào)道的5個(gè)典型PITP序列，在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用Blastp比對(duì)以及關(guān)鍵詞搜索，同時(shí)，基于SMART保守域分析，共獲得C. higginsanum 4個(gè)典型的PITP。利用生物信息學(xué)分析，初步明確了上述4個(gè)典型PITP在細(xì)胞信號(hào)肽、疏水性、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面具有的特征，為深入解析C. higginsanum PITP的功能研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。與此相似，通過(guò)上述方法，也獲得了C. graminicola中含有3個(gè)PITP，并明確上述PITP具有的相關(guān)特征。在炭疽菌屬病菌中上述2種全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，而大多數(shù)危害農(nóng)、林業(yè)生產(chǎn)的炭疽菌的全基因組測(cè)序尚未完成，因此，本研究基于C. higginsanum中典型PITP，通過(guò)遺傳關(guān)系比較分析，可為進(jìn)一步開(kāi)展其他炭疽菌屬真菌中PITP研究提供重要的理論指導(dǎo)。

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