李麗君等

摘要：為研究魚腥藻PCC7120（Anabaena sp.）基因asr0757/alr0758在毒素-抗毒素系統(tǒng)中的相關(guān)生物學(xué)功能，設(shè)計了特異性引物，擴增目的片段asr0757和alr0758，將目的基因與pMD18-T載體連接構(gòu)建克隆載體，并對其進行XhoⅠ和NdeⅠ雙酶切，再與表達載體pET-28a連接構(gòu)建表達重組菌，重組菌的體外表達在IPTG的誘導(dǎo)下進行。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果擴增出了大小為210 bp的asr0757和342 bp的alr0758目的基因。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，表達出相對分子質(zhì)量分別為8.068 kD和12.534 kD的蛋白質(zhì)。根據(jù)結(jié)果可初步認定alr0758為毒素基因，asr0757為抗毒素基因，共同構(gòu)成魚腥藻PCC7120毒素-抗毒素系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：魚腥藻PCC7120（Anabaena sp.）；毒素-抗毒素系統(tǒng)；asr0757/alr0758

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0709-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.054

A Primary Study of Genes asr0757/alr0758 in Anabaena sp. PCC7120

LI Li-jun，CHEN Si-li， MA Kai， JIANG Ze-feng， ZHOU Jiang-xu

（College of Life Science， South-central University of Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract： For the study on the related biological function of Anabaena sp. PCC7120 gene asr0757/alr0758 in toxin-antitoxin system， the specific primers were designed. The target fragments of genes asr0757/alr0758 were amplified by PCR. Their products were then inserted into pMD18-T vector after the XhoⅠ and NdeⅠ double enzyme digestion and recombinant fungus was structured by connecting the pET-28a vector， with its expression in vitro guided by IPTG. The results showed that objective gene asr0757 was 210 bp and alr0758 was 342 bp by agarose gel electrophoresis detection. Their protein molecular weight were 8.068 kD and 12.534 kD by SDS-PAGE electrophoresis detection. It can be preliminarily determined that alr0758 was the toxin gene，while asr0757 was the antitoxin gene. Both of them constituted a toxin-antitoxin system.

Key words： Anabaena sp. PCC7120； toxin-antitoxin system； asr0757/alr0758

魚腥藻PCC7120的毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)是由編碼毒素蛋白和抗毒素蛋白的2個基因?qū)餐M成的，毒素蛋白可通過影響細胞的相關(guān)生物學(xué)功能使其死亡，同時毒素也可能對人類及其他生物體造成威脅[1-4]。研究表明，根據(jù)TA系統(tǒng)編碼產(chǎn)物的序列相似性可將其分為relBE、mazEF等8個系統(tǒng)家族，且大腸桿菌染色體上的mazEF家族是目前研究最廣、遺傳背景相對清楚的TA系統(tǒng)之一[5，6]。本試驗通過分子生物學(xué)分析，對魚腥藻PCC7120基因asr0757/alr0758進行了相關(guān)研究，旨在為該基因在毒素-抗毒素系統(tǒng)中的相關(guān)生物學(xué)功能的研究提供基礎(chǔ)，為治理水華污染和開發(fā)高效的蛋白表達系統(tǒng)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藻種 藻種為魚腥藻PCC7120（Anabaena sp. PCC7120），由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病原分子生物學(xué)研究室保存（購于中國科學(xué)院水生生物研究所）。

1.1.2 主要試劑及儀器 克隆載體pMD-18T Vector、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（Takara公司），DNA聚合酶（Fermentas公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Axygene公司），E.coli DH5α、E.coli BL21、表達載體pET-28a為本實驗室保存，PCR引物合成、克隆載體及表達載體的測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

HZQ-C型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、KDC-16H型高速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、TGL-16B型臺式高速離心機（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、DYY11B型三恒電泳儀（上海金鵬分析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成以及目的基因PCR 為擴增目的基因asr0757及alr0758，先通過NCBI找到魚腥藻PCC7120的已知基因序列，再利用Oligo 7.0軟件設(shè)計4條引物：asr0757-F（5′-CC■CAGACTGATAACATAC- 3′）、asr0757-R（5′-CCG■TAATTTGTCATATTCTGCGTC-3′）、alr0758-F（5′-CC■ACAAATTATAAATTCGGGGATGTTATC

-3′）、alr0758-R（5′-CCG■GCCCGCCAAAATAATCTGTAAAAGATTATGTAAC-3′）。下劃線部分為酶切位點序列，其中“CATATG”對應(yīng)NdeⅠ、“CTCGAG” 對應(yīng)XhoⅠ。通過降落式PCR技術(shù)得到大量目的片段，并用DNA回收試劑盒對目的片段進行純化回收，為后續(xù)試驗做準備。

asr0757/alr0758 PCR程序：94 ℃ 4 min，1個循環(huán)；94 ℃ 1 min，55.5 ℃（0.5↓） /65.5 ℃（0.5↓） 1 min，72 ℃ 40 s，15個循環(huán)；94 ℃ 1 min，48 ℃/58 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，25個循環(huán)；72 ℃ 7 min，1個循環(huán)。

1.2.2 重組克隆載體的構(gòu)建 PCR擴增目的片段通過pMD-18T Vector轉(zhuǎn)化到CaCl2法制備的E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，并通過藍白斑篩選在氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基上進行雙重陽性篩選，最終挑取白色菌斑進行菌落PCR，通過測序比對，從而確定克隆載體構(gòu)建成功與否。T-A克隆體系為0.5 μL T載體、3.0 μL PCR純化產(chǎn)物、1.5 μL ddH2O、5.0 μL溶液Ⅰ。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建 用XhoⅠ和NdeⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切獲取目的基因片段，雙酶切體系見表1。通過T4 DNA連接酶將目的片段與表達載體pET-28a相連，連接體系見表2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli BL21中，使其在含卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)上培養(yǎng)，進行陽性篩選。有菌落白斑長出后，挑菌搖床過夜并取適量菌液測序以確定表達載體是否構(gòu)建成功。

1.2.4 毒素-抗毒素蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達 將含有重組質(zhì)粒的菌液接種于新鮮的含50 μg/mL抗生素（卡那霉素）的LB抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜，再取50 μL菌液活化3 h，而后加入IPTG搖床12 h誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。對樣品進行處理后，用15%分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)表達的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 asr0757/alr0758基因的擴增

應(yīng)用PCR擴增技術(shù)擴增asr0757/alr0758基因，并對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，基因片段的實際大小與預(yù)期大?。?10 bp和342 bp）相符（圖1、圖2）。

2.2 克隆載體的構(gòu)建

PCR擴增后的目的片段通過與pMD18-T載體在4 ℃條件下連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法制備的E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取陽性單菌落進行菌落PCR檢測，將菌液進行測序，結(jié)果表明2個目的基因asr0757、alr0758均成功轉(zhuǎn)入（圖3）。

2.3 表達載體的構(gòu)建

選取pET-28a上的酶切位點XhoⅠ和NdeⅠ，對克隆重組質(zhì)粒進行雙酶切，并將回收后的目的基因片段連接到表達載體pET-28a上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細胞中，挑取陽性單菌落，進行質(zhì)粒提取及雙酶切檢測，通過初步鑒定后進行測序。結(jié)果表明，表達載體成功構(gòu)建（圖4、圖5）。

由圖4可知，在asr0757基因表達菌序列比對結(jié)果中，配對率為100%，基因覆蓋率為98%。圖5為alr0758基因表達菌序列比對結(jié)果，結(jié)果表明其配對率為100%，基因覆蓋率為99%。2個基因引物設(shè)計時，均敲除了終止密碼子。

2.4 毒素-抗毒素蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達

經(jīng)測序成功的表達載體重組質(zhì)粒，在IPTG的誘導(dǎo)下進行體外表達（圖6）。結(jié)果表明，毒素-抗毒素蛋白質(zhì)在37 ℃、150 r/min的條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12 h時有蛋白質(zhì)表達，但alr0758基因表達量較少，且誘導(dǎo)劑本身對細胞生長有一定的毒性作用，所以初步認為其為毒素基因。目的毒素蛋白質(zhì)、抗毒素蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分別為8.068 kD和12.534 kD，再加上其組氨酸標記及相應(yīng)的酶切位點，分子量增加約為5 kD，故實際檢測到的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約13.068 kD和17.534 kD。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在10～15 kD之間及15～20 kD之間分別有一較為明顯的條帶，與理論值基本相符。

3 討論

本試驗設(shè)計了asr0757和alr0758基因的特異性引物，采用降落PCR擴增目的基因構(gòu)建相應(yīng)的克隆載體，再利用經(jīng)測序檢測正確的克隆重組質(zhì)粒來構(gòu)建表達載體，測序并進行序列比對后表明，目的基因均正確插入到表達載體pET-28a中，且沒有任何堿基突變出現(xiàn)，故2個目的基因表達載體均成功構(gòu)建。在表達載體的構(gòu)建過程中，載體與目的片段的最佳濃度比例為1∶6～1∶9，此比例下菌落生長狀況較好。大于1∶6的比例時，菌落幾乎不生長，故載體與目的片段比例的選取是該步驟中的一個重要因素。此外，正常生長的單菌落中，由于載體未完全切開或載體自連等原因產(chǎn)生假陽性，因此必須對重組質(zhì)粒進行測序以驗證試驗結(jié)果。

含目的基因asr0757的pET-28a-asr0757和含目的基因alr0758的pET-28a-alr0758經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)UniProtKB軟件分析可知，蛋白質(zhì)表達的大小分別為8.068 kD和12.534 kD，再加上5 kD左右的組氨酸標記及相應(yīng)酶切位點，理論大小為13.068 kD和17.534 kD。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，目的蛋白質(zhì)的分子實際大小與理論值基本相符。目的蛋白質(zhì)在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)表達，但其最佳表達條件有待進一步研究。毒素基因alr0758可能具有核酸酶活性，而已有的研究表明，具有核酸酶活性的毒素蛋白質(zhì)可通過降解mRNA抑制細胞生長[7-10]，故其表達量較少。

目前，淡水湖泊的污染形勢日趨嚴峻，而藻類是水體富營養(yǎng)化的主要媒介，且大腸桿菌細胞染色體上TA系統(tǒng)基因參與了一種特殊的環(huán)境脅迫應(yīng)答并介導(dǎo)細菌的程序性死亡[11，12]，使得對TA系統(tǒng)的研究具有十分重要的指導(dǎo)意義。本試驗成功克隆和表達了魚腥藻PCC7120染色體基因asr0757和alr0758，并對其相關(guān)性質(zhì)進行了初步研究，為后續(xù)的相關(guān)試驗奠定基礎(chǔ)。

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