陳紅漫,郭龍偉,章少在,劉姜曼,張海彥,闞國(guó)仕

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

小分子苦瓜多糖MCPⅡa的純化及結(jié)構(gòu)分析

陳紅漫,郭龍偉,章少在,劉姜曼,張海彥,闞國(guó)仕*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

利用酶解結(jié)合水溶醇沉提取水溶性的苦瓜多糖（Momordica charantia polysaccharide，MCP），經(jīng)Sevag法除蛋白、DEAE-纖維素離子交換、Sephadex G-100凝膠過濾獲得活性多糖MCPⅡa。由高效凝膠滲透色譜檢測(cè)可知MCPⅡa為均一多糖，平均分子質(zhì)量為13.0 kD，單糖組分分析顯示其單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖（各組分物質(zhì)的量比為12∶3.05∶19.89∶5.95∶56）。傅里葉紅外光譜、核磁共振及剛果紅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其存在C1、C2、C3、C5連接，在水溶液中具有穩(wěn)定的β-三股螺旋構(gòu)象，掃描電鏡下顯示其為菱形晶體顆粒。

苦瓜；多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)特征

近年來，由于多糖類化合物的重要生物學(xué)活性如免疫、抗氧化、降血糖及降血脂等，其研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[1]。隨著多糖研究技術(shù)迅速改進(jìn)和完善，國(guó)際科學(xué)界視多糖的研究為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域?？喙希∕omordica charantia）為葫蘆科（Curcubitaceae）苦瓜屬植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，不僅有良好的食用價(jià)值，而且在亞洲許多國(guó)家和地區(qū)均有降脂和降糖的入藥記載[2-5]。目前研究[6-7]表明，苦瓜有顯著的降血糖作用，其重要活性成分之一是苦瓜多糖。苦瓜多糖能夠減弱和改善鏈脲霉素對(duì)胰島β-細(xì)胞的損傷，并提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐量與肝糖原含量，說明其有益于緩解糖尿病癥狀及促進(jìn)肝糖原合成或抑制肝糖原降解而發(fā)揮降糖作用[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，具有抗氧化活性的水溶苦瓜多糖（Momordica charantia polysaccharide， MCP）Ⅱa能夠顯著降低由四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠血糖升高[9-10]。然而，盡管苦瓜多糖降血糖活性相關(guān)報(bào)道較多，但大都集中于分離提取方法、抗氧化活性、動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)等[11-12]，其活性結(jié)構(gòu)的生物學(xué)信息尚不清晰，因而限制了其作為血糖功能性食品的應(yīng)用研究。本實(shí)驗(yàn)以層析等分離純化技術(shù)明確苦瓜多糖降血糖活性組分，并利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）結(jié)合高效液相色譜（high performance liquid chromatograph y，HPLC）、紅外光譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、剛果紅實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡觀察等方法對(duì)其平均分子質(zhì)量范圍、單糖組成、糖苷鍵構(gòu)型、高級(jí)結(jié)構(gòu)、樣貌特征等進(jìn)行解析，為開發(fā)新型天然降糖活性藥物及苦瓜資源的深加工利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮苦瓜 市售；纖維素酶、DEAE-52、Sephadex G-100、標(biāo)準(zhǔn)單糖:甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall高速冷凍離心機(jī) 凱特試驗(yàn)儀器公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；UNIC7200型可見分光光度計(jì)、UNIC9100型紫外-可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；Nexus670FT-IR紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；DRX-400核磁共振儀 美國(guó)Brüker公司；2410示差折光檢測(cè)器、515型高效液相色譜儀、515型凝膠色譜儀 美國(guó)Waters公司；SU1510型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 MCP的制備

將鮮苦瓜切片后于50 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎成干粉，稱取苦瓜干粉10 g，加入40 倍水，30 mg纖維素酶，50 ℃條件下浸提5 h。收集提取液，離心，上清液再減壓濃縮至原體積的1/3，加入3 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，靜置過夜后離心。將沉淀冷凍干燥后用蒸餾水復(fù)溶，采用Sevag法脫蛋白，至游離蛋白質(zhì)完全去除，濃縮、醇沉、洗滌、真空冷凍干燥，得淡黃色粗MCP 0.76 g。

稱取MCP 600 mg溶于20 mL蒸餾水，高速離心后取上清液，過DEAE-52纖維素柱層析，依次用0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl溶液洗脫分部收集，苯酚-硫酸法檢測(cè)，繪制洗脫曲線。合并洗脫高峰部分，減壓濃縮、透析、冷凍干燥，得各部分MCP。

稱取0.1 mol/L NaCl溶液洗脫下的多糖組分（MCPⅡ）50 mg溶于10 mL蒸餾水，高速離心后取上清液，于室溫條件下進(jìn)行Sephadex G-100柱層析，0.05 mol/L NaCl溶液洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)。合并單一高峰部分，減壓濃縮、透析、高速離心、冷凍干燥，得白色MCP純品（MCPⅡa）21.17 mg。

1.3.2 MCPⅡa紫外光譜分析

將冷凍干燥后的MCPⅡa樣品配制成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL溶液，在波長(zhǎng)200～400 nm處紫外掃描，掃描間距為1 nm。

1.3.3 MCPⅡa平均分子質(zhì)量測(cè)定

取10 mg MCPⅡa溶于1 mL超純水中，采用HPGPC法分析。色譜柱:UltharydorgelTMLinear凝膠柱（7.8 mm id ×30.0 cm）；流動(dòng)相:超純水；洗脫流速:1 mL/min；柱溫:50 ℃；樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量各20 ?L。根據(jù)HPGPC的洗脫峰形確定純度，由標(biāo)準(zhǔn)多糖Dextran T-2000、T-500、T-70、T-10、T-5（分子質(zhì)量分別為2 000、500、70、10、5 kD）的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線及GPC軟件計(jì)算樣品平均分子質(zhì)量。

1.3.4 MCPⅡa單糖組成分析

稱取10 mg樣品，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，120 ℃條件下密封水解1 h，減壓濃縮。取減壓蒸干的多糖樣品分別依次加入0.5 mol/L的（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）-甲醇溶液0.5 mL和0.3 mol/L NaOH溶液1 mL，混勻，70 ℃反應(yīng)30 min。待冷卻至室溫，用0.3 mol/L鹽酸溶液1 mL中和。減壓蒸干，然后再溶解于1 mL水中，加入2 mL氯仿萃取，離心，吸棄下層溶液，同法重復(fù)操作2 次。取上層水相，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液供HPLC進(jìn)樣分析。

供HPLC檢測(cè)分析同時(shí)，用經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)單糖作參照。HPLC檢測(cè)條件: SunFireTMC18色譜柱（4.6 mm id×25.0 cm）；示差折光檢測(cè)器；柱溫26 ℃；流動(dòng)相:V（乙腈）∶V（水）= 80∶20；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.5 MCPⅡa紅外光譜分析

取冷凍干燥后的MCPⅡa 1 mg與300 mg干燥的KBr混勻，研磨，壓片，于紅外光譜儀波數(shù)400～4 000 cm-1中紅外區(qū)掃描，測(cè)定透光率。

1.3.6 剛果紅實(shí)驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖樣品溶液，8.39×10-4mol/L的剛果紅溶液，濃度分別為0～0.5 mol/L NaOH溶液，取1 mL的樣品溶液加入1 mL剛果紅溶液、2 mL NaOH溶液，混勻，室溫條件下靜置15 min，于波長(zhǎng)400～600 nm處進(jìn)行光譜掃描，記錄剛果紅在不同濃度NaOH溶液中的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.7 NMR分析

精密稱取充分干燥的MCPⅡa 15 mg，溶于0.5 mL重水中，冷凍干燥，如此重復(fù)用重水交換3 次，再溶于0.5 mL重水后，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過后在DRX-400 NMR儀上進(jìn)行13C-NMR分析。

1.3.8 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

將適量樣品溶于超純水中，取1～2 滴溶液滴于蓋玻片上，置于30 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。將蓋玻片粘于樣品臺(tái)，噴金后，在高真空模式下觀察樣品表面形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCPⅡa的紫外掃描分析

MCPⅡa脫蛋白后其水溶液在紫外-可見光波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)掃描顯示，經(jīng)脫蛋白后，在波長(zhǎng)260 nm（核酸的特征吸收峰）和波長(zhǎng)280 nm處（蛋白的特征吸收峰）吸收峰不明顯，說明MCPⅡa中幾乎不含有蛋白質(zhì)和核酸（圖1）。

2.2 MCPⅡa純度和平均分子質(zhì)量

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:lgMw=-0.119 0tR+ 8.479 6，式中:Mw為平均分子質(zhì)量/kD；tR為保留時(shí)間/min；相關(guān)系數(shù)R2為0.997 3。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得MCPⅡa的平均分子質(zhì)量為13 kD。圖2中色譜峰形單一，均勻?qū)ΨQ，可確認(rèn)MCPⅡa為均一多糖。

2.3 MCPⅡa的單糖組成分析

經(jīng)HPLC分析后，用面積歸一化法得MCPⅡa的單糖組成及其物質(zhì)的量比為鼠李糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖=12∶3.05∶19.89∶5.95∶56，色譜圖見圖3。

2.4 MCPⅡa的紅外光譜分析

從圖4可以看出，3 420.4 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是糖分子中O—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收。2 922.2 cm-1處的吸收峰是—CH2—次甲基的C—H伸縮振動(dòng)引起的。在1 736.4 cm-1處出現(xiàn)了甲氧酯基的—C＝O伸縮振動(dòng)的吸收峰。1 419.9 cm-1處的吸收峰是C—O伸縮振動(dòng)引起的[13]。1 384.1 cm-1處吸收峰是＝CH2的變形吸收峰。1 247.4 cm-1處的吸收峰是C—H的變角振動(dòng)。在1 100 cm-1與1 010 cm-1之間的吸收峰（1 072.2 cm-1），提示中可能含有吡喃糖[14]。894.1 cm-1處的吸收峰是β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰[15]。620.8 cm-1為吡喃型糖環(huán)特征吸收峰。由以上分析，可推知該多糖組分含有β-D-吡喃糖環(huán)，分子以β-糖苷鍵連接。

2.513C-NMR圖譜分析

對(duì)于13C-NMR圖譜，α型的化學(xué)位移為δ 97～101，β型的化學(xué)位移為δ 103～105。由圖5分析可知，MCPⅡa糖鏈主要是β構(gòu)型（δC104.92），有少量為α構(gòu)型（δC99.61）。δ 170～180范圍的低場(chǎng)信號(hào)δC176.31反映有己糖醛酸的羧基或乙?；拇嬖凇＆?90～112為異頭碳（C1）的共振區(qū)，糖端基碳化學(xué)位移的信號(hào)區(qū)。一般還原末端的C1出現(xiàn)在δ 90～98間，取代碳水化合物的C1（非還原單糖）出現(xiàn)在δ 98～112，據(jù)此可推斷多糖的聚合程度。由圖5可看出，在δ 96.83～107.23的低磁場(chǎng)領(lǐng)域，出現(xiàn)了多個(gè)異頭碳信號(hào)峰，說明MCPⅡa中的聚合度較高，糖鏈比較復(fù)雜。δ 60～78為己碳糖環(huán)上其他位碳（C2、C3、C4、C5和C6）的共振區(qū)，非端基碳的信號(hào)區(qū)。

2.6 MCPⅡa的構(gòu)象分析

剛果紅可以與具有三股螺旋構(gòu)象的多糖形成配合物，配合物的最大吸收波長(zhǎng)同剛果紅相比會(huì)發(fā)生紅移，且在一定的NaOH濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)亞穩(wěn)性，即最大吸收波長(zhǎng)的特征變化[16-17]。從圖6可以看出，MCPⅡa與剛果紅發(fā)生絡(luò)合作用，在NaOH濃度0～0.5 mol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)為最大吸收波長(zhǎng)的特征變化，且吸收波長(zhǎng)并沒有出現(xiàn)大幅度改變，可以推斷出MCPⅡa具有較為穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.7 MCPⅡa掃描電鏡

由圖7可知，當(dāng)放大倍數(shù)為17 000 倍時(shí)，MCPⅡa結(jié)構(gòu)較為規(guī)則，在電鏡下呈現(xiàn)為菱形顆粒 狀。掃描 電鏡結(jié)果為MCPⅡa在微米尺度的顯微形貌特征提供了直觀的信息。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶法提取MCP，通過Sevag法脫蛋白后，經(jīng)DEAE-52分離純化得到0.1 mol/L NaCl溶液洗脫組分MCPⅡ，通過SephadexG-100凝膠柱純化后，得到MCPⅡa。實(shí)驗(yàn)表明，MCPⅡa為均一多糖，平均分子質(zhì)量為13.0 kD，由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖5 種單糖組成，其中阿拉伯糖含量占50%以上，可初步推斷MCPⅡa是以阿拉伯糖為主，可能帶有多個(gè)分支的酸性雜多糖。光譜分析表明，MCPⅡa其糖鏈構(gòu)型主要為β構(gòu)型，分子以β-糖苷鍵連接，含有β-D-吡喃葡萄糖環(huán)，且存在C1、C2、C3、C5連接?？臻g構(gòu)象研究表明，MCPⅡa在水溶液中具有較為穩(wěn)定三股螺旋結(jié)構(gòu)。電鏡結(jié)果顯示，MCPⅡa呈現(xiàn)為外形規(guī)整的菱形顆粒狀晶體。

有關(guān)多糖的研究表明，多糖的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性有著密切的關(guān)系[18-21]。例如，分子質(zhì)量與多糖的溶解度和黏度有關(guān)，而溶解度和黏度影響著多糖的生物活性及實(shí)際應(yīng)用；大分子質(zhì)量多糖體積較大，不利于跨越多重細(xì)胞膜障礙進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性[22]。MCPⅡa為小分子質(zhì)量苦瓜多糖，其生物活性更容易在體內(nèi)發(fā)揮，適宜開發(fā)利用。多糖主鏈的構(gòu)型有α構(gòu)型和β構(gòu)型2 種。對(duì)于葡聚多糖而言，α-葡聚糖一般沒有活性，主要是因?yàn)槿梭w內(nèi)存在α-葡萄糖苷酶，能使α-糖苷鍵發(fā)生水解；而對(duì)于其他類型的多糖，具有生物學(xué)活性者也多是β構(gòu)型[23]。一般認(rèn)為，空間構(gòu)像比初級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)多糖活性的影響更大，多糖的特定空間構(gòu)像是其產(chǎn)生生物學(xué)活性所必需的，如具有抗腫瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋結(jié)構(gòu)[24]；經(jīng)硫酸酯化的巖藻低聚糖表現(xiàn)出明顯的抗HSV病毒活性，且隨著硫酸酯化程度的增加而增強(qiáng)[25]；從金釵石斛莖中提取的果膠多糖DNP-W5的免疫活性的表達(dá)，與其分支結(jié)構(gòu)及乙酰基有著重要關(guān)系[26-27]。而剛果紅實(shí)驗(yàn)研究表明，MCPⅡa在水溶液中具較為穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步說明苦瓜多糖具有著潛在的開發(fā)價(jià)值。

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Purification and Structural Analysis of a Polysaccharide from Bitter Gourd (Momordica charantia)

CHEN Hongman, GUO Longwei, ZHANG Shaozai, LIU Jiangman, ZHANG Haiyan, KAN Guoshi*
(College of Bioscience and Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

In this research, a water-soluble polysaccharide (MCP Ⅱa) w as extracted from Momordica charantia by cellulase hydrolysis, precipitated with ethanol, and then puri?ed by DEAE-52 cellulose anion-exchange and Sephadex G-100 gel?ltration chromatography. The high performance gel permeation chromatography (HPGPC) analysis showed that the average molecular weight of MCP Ⅱa was 13.0 kD. Monosaccharides analysis revealed that the MCP Ⅱa was composed of Rha, GalA, Gal, Xyl and Ara with a relative molar ratio of 12:3.05:19.89:5.95:56. Infrared (IR) spectrum,13C-nuclear magnetic resonance (NMR) and Cango-red tests indicated that MCP Ⅱa formed a β-triple helix in aqueous solution and the C1, C2 and C3, C5 positions were its binding sites. Moreover, it existed as a rhombus crystal under a scanning electron microscope.

Momordica charantia; polysaccharide; purification; structural analysis

O629.12

A

10.7506/spkx1002-6630-201510018

2014-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31271842)

陳紅漫(1969—),女,副教授,博士,主要從事食品生物化學(xué)研究。E-mail：chenhm99@sina.com

*通信作者：闞國(guó)仕(1971—),男,副教授,碩士,主要從事酶學(xué)與生物活性物質(zhì)研究。E-mail：kanguoshi@163.com