結(jié)核分枝桿菌耐藥突變檢測(cè)的臨床研究

朱蔚崗, 周穩(wěn)蘭, 李軍, 花心萍, 曹素珍, 盧應(yīng)梅, 紀(jì)曉燕

(江蘇省泰州市第二人民醫(yī)院 感染病科, 江蘇 泰州, 225599)

關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌; 抗結(jié)核藥物; 耐藥性

近年來，中國的結(jié)核病發(fā)病率和耐藥率均有上升趨勢(shì)，每年有將近12萬新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者，未來數(shù)年內(nèi)可能出現(xiàn)耐藥菌為主的流行態(tài)勢(shì)[1]。耐藥結(jié)核病常規(guī)的疫情監(jiān)測(cè)不僅是臨床用藥和評(píng)價(jià)化療方案的重要依據(jù),也是流行病學(xué)和結(jié)核病控制工作的重要指標(biāo)[2]。如何快速、準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)主要一線藥物的耐藥性具有重要的臨床意義。據(jù)報(bào)道異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG有關(guān)[3], 同時(shí)還有研究[4]證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌耐利福平與RNA聚合酶的β亞基的編碼基因rPOB 的突變有關(guān)。本研究檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素的耐受性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

分析本院2012年6月—2014年6月診治肺結(jié)核患者，選擇其中痰涂片結(jié)核分枝桿菌陽性164株，提取痰液中涂陽標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2方法

檢測(cè)方法為PCR-反向點(diǎn)雜交法，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增和熔解曲線分析技術(shù)對(duì)痰液涂片陽性標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)特定藥物：利福平突變位點(diǎn)rpoB507-533; 異煙肼突變位點(diǎn)KatG315, inhA啟動(dòng)子, inhA94, ahpC啟動(dòng)子；乙胺丁醇突變位點(diǎn)em6B306, 368, 378, 380, 406, 497; 鏈霉素突變位點(diǎn)rrs512環(huán), 904環(huán), rpsL43,88進(jìn)行檢測(cè)，技術(shù)及報(bào)告由深圳亞能醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供，通過檢測(cè)突變位點(diǎn)，診斷篩查出耐藥結(jié)核患者。

1.3耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)

單耐藥，對(duì)一種抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥，對(duì)一種以上抗結(jié)核藥物耐藥，但不包括同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥；耐多藥，至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥；廣泛耐藥，對(duì)異煙肼和利福平耐藥外，同時(shí)還對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素耐藥。

2結(jié)果

2.1菌株總的耐藥分布

對(duì)164株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行抗結(jié)核藥耐藥性測(cè)定，其中有41株結(jié)核分枝桿菌耐藥，總耐藥率為25%。四種抗結(jié)核藥物的耐藥率分別是：耐異煙肼31株(75.6%), 耐利福平27株(65.9%), 耐乙胺丁醇13株(31.7%), 耐鏈霉素19株(46.3%)。

2.2耐藥情況統(tǒng)計(jì)

41株耐藥結(jié)核分枝桿菌中，耐1藥12例(29.3%)，耐2藥13例(31.7%)，耐3藥12例(29.3%)，耐4藥4例(9.8%)。其中4種抗結(jié)核藥物中耐藥情況分別為: ① 耐單藥共12例(7.3%): H耐藥6株，耐藥率14.6%; R耐藥4株，耐藥率9.8%; S耐藥2株，耐藥率4.9%; ② 多耐藥共10例(6.1%): H+S耐藥6株，耐藥率14.6%; R+E耐藥1株，耐藥率2.4%; R+S耐藥2株，耐藥率4.9%; R+E+S耐藥1株，耐藥率2.4%; ③ 耐多藥共15例(9.1%): H+R+E耐藥7株，耐藥率17.1%; H+R+S耐藥4株，耐藥率9.8%; H+R耐藥4株，耐藥率9.8%; ④ 廣泛耐藥共4例(2.4%): H+R+E+S耐藥4株，耐藥率9.8%。164株結(jié)核分枝桿菌中總耐多藥率為11.6%(19/164), 其中廣泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)占耐多藥結(jié)核(MDR-TB)病例達(dá)21.1%(4/19)。

3討論

近年來結(jié)核病疫情呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，由于抗結(jié)核藥物的不規(guī)范治療，患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌對(duì)多種抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥，從而形成耐多藥結(jié)核病，這是結(jié)核病疫情重新上升的最主要原因之一[5]。結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的快速鑒定對(duì)結(jié)核病早期治療和控制耐藥菌的傳播具有重要的意義。

本研究通過PCR-反向點(diǎn)雜交法技術(shù)，對(duì)痰涂片結(jié)核分枝桿菌陽性164株菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示結(jié)核分支桿菌耐藥率為25%(41/164)，其中對(duì)異煙肼、利福平兩種以上抗結(jié)核藥物耐藥(耐多藥)率為11.6%(19/164)。而2000年進(jìn)行的第4次全國結(jié)核流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國結(jié)核病耐藥率為27.8%，耐多藥率為10.7%[6]。上述數(shù)據(jù)比較說明該檢測(cè)方法的可行性及準(zhǔn)確性。從耐多藥比值看，本組數(shù)據(jù)比例稍高，也說明了近幾年來耐多藥結(jié)核有所增加。從耐藥情況分析看，耐藥株對(duì)4種抗結(jié)核藥物的單藥耐藥率分別為：耐異煙肼75.6%，耐利福平65.9%，耐鏈霉素46.3%，耐乙胺丁醇31.7%；耐藥順序?yàn)椋篐>R>S>E，其中耐2、3、4種一線抗結(jié)核藥物明顯增高，導(dǎo)致多耐藥、耐多藥、廣泛耐藥患者比例增高，特別是本地區(qū)廣泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)占耐多藥結(jié)核(MDR-TB)達(dá)21.1%, 與研究[7]報(bào)道北京地區(qū)2002—2005年發(fā)現(xiàn)13例廣泛耐藥結(jié)核病例，占同期耐多藥結(jié)核病例的6.28%的結(jié)果要明顯增多。

廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)產(chǎn)生的原因主要是由于結(jié)核病控制措施的薄弱和不足、二線抗結(jié)核藥物使用不當(dāng)。有研究[8]表明, XDR-TB的形成與先前抗結(jié)核的藥物總共服用時(shí)間及選用的二線抗結(jié)核藥物的種類關(guān)系密切；其他新近的抗結(jié)核藥物研究和臨床應(yīng)用較延遲且價(jià)格不菲，不能廣泛地應(yīng)用于臨床并及時(shí)治愈耐藥結(jié)核病，從而耐藥程度越來越重，最終形成對(duì)抗結(jié)核藥物的廣泛耐藥。因此，做好預(yù)防工作，盡量減少發(fā)展為耐藥結(jié)核病的概率，臨床上盡早行藥物敏感性試驗(yàn)，選擇敏感藥物治療，加快抗結(jié)核新藥的研發(fā)，使結(jié)核病患者在最短時(shí)間內(nèi)治愈，以防發(fā)展成為耐藥結(jié)核病。這些數(shù)據(jù)反映了本地區(qū)結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌的耐藥現(xiàn)狀，也是造成本地區(qū)肺結(jié)核難治的重要原因之一。

中國肺結(jié)核復(fù)治患者的耐藥率大部分地區(qū)在60%以上，屬高復(fù)治耐藥病例的國家[9], 而發(fā)達(dá)國家低于30%,多種耐藥率高。自RFP、EMB等應(yīng)用以后，復(fù)治病例的耐藥率由耐1、2種藥物變?yōu)槟?、4種藥物，甚至有耐藥7、8種的病例[10]。引起結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的外部因素主要為不規(guī)則治療，內(nèi)部因素為耐藥基因的產(chǎn)生與突變，在單株結(jié)核分枝桿菌中可同時(shí)有幾種耐藥基因的突變，進(jìn)而引起多耐藥菌株的產(chǎn)生。耐藥基因的檢測(cè)更能反映細(xì)菌在體內(nèi)對(duì)抗菌藥物的作用結(jié)果，因此加強(qiáng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因的檢測(cè)有重要的臨床價(jià)值[11]。一直以來，結(jié)核病診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法主要包括分枝桿菌分離培養(yǎng)、抗酸菌痰涂片鏡檢、菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)等，但是其普遍存在特異性差、靈敏度低或需時(shí)長等缺點(diǎn)。本研究采用方法與傳統(tǒng)結(jié)核菌培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)方法相比具有時(shí)間短、數(shù)小時(shí)內(nèi)可完成等特點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇等4種主要一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，具有較高的特異性和敏感性，能夠快速診斷并篩查出耐藥結(jié)核患者，從而為患者盡快提供有效的診療方案。

參考文獻(xiàn)

[1]Roues D A, Li Z M, Bai G H, et al. Characterization of the KatG and inhAgenes of isoniazid-resistant clinical isolates of M. tuberculosis[J]. Chern other, 1995, 39: 2472.

[2]方紅輝, 唐曙明, 李芳芳, 等. 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2008, 15(5): 1392.

[3]許麗, 楊應(yīng)周, 吳清芳, 等. 深圳市結(jié)核病一線抗結(jié)核藥的耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J]. 中國防癆雜志, 2010, 32(4): 204.

[4]姚春艷, 張立群, 府偉靈. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2010, 20(11): 1501.

[5]全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第4次全國結(jié)核流行病抽樣調(diào)查報(bào)告[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2002, 25(1): 6.

[6]SUN Z, CHAO Y, ZHANG X, et al. Characterization of Extensively Drug-Resistant Mycobacterrium tuberculosis Clinical Isolates in China[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(12): 4075.

[7]唐神結(jié). 耐藥結(jié)核病防治手冊(cè)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009: 96.

[8]仵倩紅, 王西臨. 388例患者結(jié)核分枝桿菌耐藥情況分析[J]. 臨床肺科雜志, 2011, 16(4): 550.

[9]安立群, 王擷秀, 孫忠, 等. 656株結(jié)核分枝桿菌耐藥情況分析[J]. 中國慢性病預(yù)防與控制, 2011, 19(2): 36.

[10]Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, et al. Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacteium complex isolates[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(8): 3699.

[11]王峰, 桂靜, 趙廣錄, 等.基因芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平異煙肼耐藥性的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012,35(12): 1125.

基金項(xiàng)目:江蘇省泰州市科技支撐社會(huì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(泰科2013-156-188)

收稿日期:2014-11-07

中圖分類號(hào):R 378.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)03-110-02

DOI:10.7619/jcmp.201503034