丁紅，黃維義，沈桂冬

(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2安康市中心醫(yī)院)

姜黃素對人臍靜脈血來源內皮祖細胞HO-1表達的影響及機制探討

丁紅1，2，黃維義1，沈桂冬2

(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2安康市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察姜黃素(CMN)對人臍靜脈血來源內皮祖細胞(EPCs)血紅素氧合酶1(HO-1)蛋白表達的影響，并探討其機制。方法采用密度梯度離心法體外分離、培養(yǎng)人臍靜脈血單個核細胞，以免疫熒光法觀察細胞吸收Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1情況并同時進行CD133免疫熒光鑒定EPCs。將EPCs分為0、5、10、15 μmol/L CMN組，分別以終濃度為0、5、10、15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基孵育24 h，檢測各組HO-1蛋白表達、細胞增殖能力及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活力。將EPCs分為單純組、CMN組、CMN+ATRA組，分別在單純培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培養(yǎng)基中孵育24 h，檢測各組HO-1蛋白表達。結果 從臍靜脈血分離出來的單核細胞培養(yǎng)3～4 d開始貼壁，7 d后有一定方向性，呈簇狀生長，免疫熒光檢測顯示CD133表面標記陽性率及DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性率均>90%。隨CMN濃度升高，EPCs的HO-1蛋白表達逐漸升高(P均<0.05)，細胞增殖能力逐漸增強(P均<0.05)，細胞培養(yǎng)液中LDH活力則無明顯改變(P均>0.05)。與單純組比較，CMN組、CMN+ATRA組HO-1蛋白表達量增加(P均<0.05)，且后兩組比較，P<0.05。結論CMN可誘導人臍靜脈血來源EPCs高表達HO-1蛋白，這可能與Nrf2/ARE信號途徑有關。

關鍵詞：姜黃素；血紅素氧合酶1；內皮祖細胞

內皮祖細胞(EPCs)是成熟內皮細胞的前體細胞，具有增殖、遷移、分化為成熟內皮細胞和聚集形成新生血管的作用，主要參與胚胎時期的血管生成，也廣泛參與成人的血管修復與再生。循環(huán)中EPCs的數量與功能決定著損傷血管的內皮修復程度，可作為評估內皮功能及獨立預測動脈粥樣硬化病程和冠心病患者預后的指標[1]。血紅素氧合酶1(HO-1)是細胞內的一種可誘導的重要保護酶，在調節(jié)細胞周期、應對炎癥與氧化應激損傷中均發(fā)揮著不可或缺的作用[2]。已有研究[3,4]顯示，人為上調HO-1表達可增加循環(huán)中EPCs的數量與功能，顯著增強對損傷血管的修復并促進缺血梗死區(qū)血管新生，從而改善包括冠心病在內的動脈粥樣硬化患者的預后。近年發(fā)現一種天然的植物藥用成分姜黃素(CMN)，其是HO-1的強誘導劑，抗炎、抗氧化損傷與組織細胞保護作用均有賴于其對HO-1蛋白的誘導表達。本實驗觀察了CMN對人臍靜脈血來源EPCs中HO-1表達的影響，并探討其可能的機制。

1材料與方法

1.1主要試劑CMN、全反式視磺酸(ATRA)購自美國Sigma公司；硫氰酸熒光素標記荊豆凝集素1(FITC-UAE-1)、Dil標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)和鼠抗人CD133抗體購自R&D SYSTEMS公司；兔抗HO-1抗體(ab13243)購自abcam公司；二抗購自江蘇碧云天生物公司；CCK-8購自碧云天生物研究所；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；新生兒臍靜脈血采集于瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院產科足月剖宮產健康產婦，采集標本均經患者及家屬同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑配制CMN配制:取CMN(相對分子質量368.37)3.683 mg溶于100 μL DMSO中即得到200 μmol/L的標準液，4 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?。ATRA配制：取10 mg ATRA(相對分子質量300.4)溶于3 329 μL DMSO中即得到10 mol/L的標準液，-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人臍靜脈血中單個核細胞的分離、培養(yǎng)及EPCs的鑒定將人臍靜脈血分離獲得單個核細胞后制成重懸細胞，調整細胞密度為4×106/mL后接種于完全培養(yǎng)基的纖連蛋白包板的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2、95%濕度恒溫孵育箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)至第7天，進一步用PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞供實驗用。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，24 h后可見少量細胞貼壁，主要是成纖維細胞，懸浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h時，細胞開始大量貼壁，細胞形態(tài)由圓形變?yōu)闄E圓形并出現集落樣生長傾向；第7天梭形細胞增多，細胞生長有一定方向性。培養(yǎng)第7天的細胞CD133免疫熒光檢測呈綠色，陽性率達90%以上。取培養(yǎng)第9天的細胞制作爬片，先后加入內皮細胞特異性抗體FITC-UAE-1、Dil-ac-LDL孵育，熒光顯微鏡觀察見雙染的黃色細胞達90%以上。

1.2.3EPCs分組及處理實驗一：將EPCs分為0、5、10、15 μmol/L CMN組，分別以終濃度為0、5、10、15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基孵育24 h；實驗二：將EPCs分為單純組、CMN組、CMN+ATRA組，分別在單純培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN的培養(yǎng)基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培養(yǎng)基中孵育24 h。

1.2.4各組EPCs中HO-1蛋白檢測采用Western blotting法。收集實驗一及實驗二各組細胞，加入裂解液裂解60 min，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，取上清液以BCA法檢測蛋白濃度。80 V恒壓SDS-PAGE電泳，待蛋白樣品到達濃縮膠與分離膠交界處時換用150 V繼續(xù)電泳，后轉移至PVDF膜上，TBST液封閉洗滌，以1∶200一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，以1∶2 000二抗稀釋液室溫下孵育1 h，在PVDF膜上均勻地涂抹化學發(fā)光底物，棄發(fā)光液，以一層保鮮膜輕輕覆蓋在PVDF膜上，在暗室內將X線片置于其上，放入暗盒中曝光5 min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。以β-actin為內參，采用Quantity One圖像分析軟件分析其相對表達量。

1.2.5CMN對EPCs毒性及細胞增殖的影響取實驗一中各組上清液，按檢測試劑盒說明書方法檢測LDH活力。收集實驗一中各組細胞，按CCK-8檢測試劑盒說明書方法檢測細胞增殖能力。

2結果

2.1CMN對EPCs HO-1蛋白表達的影響檢測結果0、5、10、15 μmol/L CMN組HO-1光密度比值分別為0.65±0.02、0.87±0.08、1.25±0.05、1.34±0.03，EPCs的HO-1蛋白表達量隨CMN濃度的升高而逐漸增加(P均<0.05)。單純組、CMN組、CMN+ATRA組HO-1光密度比值分別為0.47±0.04、1.43±0.02、1.11±0.05，與單純組比較，CMN組、CMN+ATRA組HO-1表達量增加(P均<0.05)，且后兩組比較，P<0.05。

2.2CMN對EPCs毒性及細胞增殖的影響CMN對EPCs無明顯毒性損傷作用；CMN濃度越高，EPCs增殖活力越強。詳見表1。

注：與0 μmol/L CMN組比較，*P<0.05；與5 μmol/L CMN組比較，$P<0.05；與10 μmol/L CMN組比較，#P<0.05。

3討論

CMN是從姜黃、郁金等植物根莖中提取的一種生物多酚化合物。傳統(tǒng)醫(yī)學認為其具有破瘀、行氣、消積和通經止痛的功效?，F代藥理學研究[2]顯示，CMN具有抗炎、抗氧化、抑制動脈粥樣硬化、抗病毒等作用。WHO/FAD已允許將其作為天然調味劑及食用色素使用，近年被廣泛用于化妝品及炎癥治療。研究[5,6]已證實CMN能誘導多種細胞高表達HO-1蛋白。本實驗結果表明，CMN能誘導EPCs表達HO-1蛋白，且在0~15 μmol/L范圍內具有劑量依賴性。HO-1廣泛分布于哺乳動物各種組織細胞的微粒體內，生理狀態(tài)下只有少量表達，病理狀態(tài)下表達增多。近年有研究報道，一些本不具有致氧化應激作用的生物黃酮類物質也能通過特定的細胞內信號途徑誘導HO-1表達。本研究小組也曾報道銀杏黃酮能通過TPK(酪氨酸蛋白激酶)信號途徑誘導大鼠主動脈平滑肌細胞內HO-1顯著表達[7]。已知核因子E2相關因子2(Nrf2)是一個具有堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的重要細胞保護性轉錄因子，可在各種細胞內表達并與DNA的NF-E2區(qū)結合，而NF-E2區(qū)包含有抗氧化反應元件(ARE)序列(GTGACTCAGCA)。ARE是許多抗氧化酶/蛋白基因上游中的順式作用增強元件，Nrf2則參與對ARE的調節(jié)，從而在ARE介導的抗氧化基因表達中起重要作用。Nrf2/ARE信號通路能激活其下游的保護性蛋白HO-1表達。生理狀態(tài)下Nrf2與胞質蛋白伴侶分子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keapl)結合，其活性處于相對抑制狀態(tài)，在半胱氨酸殘基發(fā)生氧化的情況下，Nrf2與Keapl解耦連后轉移入核，與ARE結合，啟動ARE調控的抗氧化酶基因如HO-1表達[8]。研究[9]發(fā)現，ATRA主要通過激活視磺酸(RA)的α受體，減少核中的Nrf2與ARE結合，從而特異性抑制Nrf2-ARE的形成，致使包括HO-1在內的抗氧化酶基因表達減少。尹聞科等[5]報道，CMN能通過Nrf2/ARE信號通路上調SH-SY5Y細胞中HO-1表達。本實驗結果表明CMN也是通過Nrf2/ARE信號通路誘導EPCs中的HO-1表達。但所加用的ATRA并沒有完全阻斷HO-1的表達，其原因可能是ATRA的用量不足以達到完全阻斷的效果，也可能是CMN誘導HO-1表達還存在其他的細胞內信號機制，需要進一步的實驗證實。

本實驗還監(jiān)測了CMN對EPCs可能存在的毒性作用。LDH是催化乳酸和丙酮酸相互轉換的酶，廣泛存在于所有組織細胞中，在細胞損傷時釋放，且釋放量與細胞損傷程度呈正比，定量測定培養(yǎng)液中LDH活性即可作為細胞損傷程度的一種敏感且簡便的指標。本實驗發(fā)現隨CMN濃度升高，細胞增殖活力逐漸增強，而LDH活力卻沒有出現明顯升高，在5 μmol/L CMN時反而降低，這可能與我們的實驗誤差有關，但LDH的這種變化并沒有達到統(tǒng)計學差異，表明CMN對EPCs沒有細胞毒性，并能促進細胞的增殖活力。

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Effect of curcumin on HO-1 expression in endothelial progenitor cells from human umbilical vein blood

DINGHong1,HUANGWei-yi,SHENGui-dong

(1TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of curcumin (CMN) on the HO-1 protein expression in endothelial progenitor cells (EPCs) from human umbilical vein blood and to investigate the mechanisms. MethodsThe mononuclear cells were isolated and cultured by density gradient centrifugation from human umbilical vein blood. The morphology of EPCs was observed with inverted microscope，EPCs were also identified as adherent cells which were double positive for Dil-ac-LDL/FITC- UAE-1 by immumofluorescence method, and their expression of CD133was detected. EPCs were divided into four groups and incubated with 0, 5, 10 and 15 μmol/L CMN respectively for 24 h. Then the HO-1 protein expression, the cell proliferation activity and the Lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant were detected. EPCs were divided into three groups and incubated with 0 μmol/L CMN (simple group), 15 μmol/L CMN (CMN group) and 15 μmol/L CMN+1 μmol/L all-trans retinoic acid (ATRA) (CMN+ATRA group) respectively for 24 h. The HO-1 protein expression was detected. ResultsAttached cells were observed after 3-4 days and cluster growth was noticed after 7 days. The immunofluorescence showed that the positive rate of CD133, the double staining positive rates of DiI-acLDL and FITC-UEA-1 were all more than 90%. With the increase of CMN concentration, the expression of HO-1 protein in the EPCs increased gradually (all P<0.05), and the cell proliferation increased significantly (all P<0.05), but the LDH activity in the supernatant did not change obviously (all P>0.05). Compared with simple medium group, the expression of HO-1 protein in the CMN and CMN+ATRA group increased (all P<0.05), and significant difference was found between the CMN and CMN+ATRA groups (P<0.05). ConclusionCMN may effectively induce the high protein expression of HO-1 in EPCs, which is related with Nrf2/ARE signal pathway.

Key words:curcumin; heme oxygenase-1; endothelial progenitor cells

(收稿日期：2014-11-26)

通信作者簡介：黃維義(1968-)，男，主任醫(yī)師，教授，研究方向為心臟介入治療。E-mail:hwy6881@126.com

作者簡介：第一丁紅(1979-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為心臟介入治療。E-mail:dinghongyisheng@163.com

基金項目：瀘州市人民政府—瀘州醫(yī)學院科技戰(zhàn)略合作科技項目(2013LZLY-J15)。

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.006