miR-93轉(zhuǎn)染對胃癌細胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響及機制探討

趙立剛，姜維民，董茂盛

(中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京100088)

摘要：目的觀察上調(diào)miR-93表達對人胃癌細胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響，并探討其可能機制。方法將miR-93模擬物及其陰性對照物分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC-7901，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞的miR-93，細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗分別檢測轉(zhuǎn)染細胞的遷移及侵襲能力，qRT-PCR和Western blotting檢測轉(zhuǎn)染細胞的染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5(CHD5)mRNA和蛋白。結(jié)果與轉(zhuǎn)染陰性對照物的SGC-7901細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-93模擬物的SGC-7901細胞miR-93表達明顯增加(P<0.01)、遷移和侵襲能力增強(P均<0.05)、CHD5 mRNA及蛋白表達下調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論 過表達miR-93可促進SGC-7901細胞的遷移和侵襲，其機制可能與CHD5表達下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：微小RNA；微小RNA93；胃癌；胃癌細胞株SGC-7901；染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5；癌細胞遷移；癌細胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.011

中圖分類號：R735.2文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-08-24)

通信作者：董茂盛

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，病死率占我國腫瘤相關(guān)死亡率的第4位[1]，復發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因。因此，尋找一種特有的、能夠早期阻斷胃癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的靶向分子，對于胃癌的治療具有重要意義。microRNAs(miRNAs) 是一類非編碼單鏈RNA，包含19～25個核苷酸，通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合而抑制靶基因的翻譯，影響其蛋白表達，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[2]。過表達miR-93能夠促進食管癌細胞[3]、鼻咽癌細胞[4]、膠質(zhì)瘤細胞[5]的增殖及遷移。染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5 (CHD5)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，CHD5在肝細胞肝癌[6]、胰腺癌[7]、膽囊癌[8]等多種腫瘤組織中呈低表達甚至表達缺失，提示CHD5在腫瘤的發(fā)生過程中起到了重要作用。2015年5月10日～6月31日，我們將miR-93模擬物(miR-93mimics)轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC-7901，檢測細胞遷移和侵襲能力、CHD5 mRNA及蛋白，觀察過表達miR-93對SGC-7901細胞遷移及侵襲能力的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑細胞：人胃癌細胞株SGC-7901由中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院中心實驗室惠贈。主要試劑：DMEM及Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco, 美國)，胎牛血清、LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美國)，CHD5兔抗人單克隆抗體及山羊抗兔二抗、α-Tubulin鼠抗人單克隆抗體及山羊抗鼠二抗(Santa Cruz, 美國)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京天根)，miR-93 mimics及陰性對照、RNA提取試劑TRIzol、 qRT-PCR探針及引物試劑盒(蘇州吉瑪)，Transwell小室(Corning，美國)，Matrigel基質(zhì)膠(BD，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及miR-93轉(zhuǎn)染將SGC-7901細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、95% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將對數(shù)生長期SGC-7901細胞接種于6孔板并分為兩組，待細胞生長至70%左右融合時進行轉(zhuǎn)染：miR-93 mimics轉(zhuǎn)染組(SGC-7901-miR-93組)加入LipofectamineTM2000、Opti-MEM及miR-93 mimics(終濃度100 nmol/L)；轉(zhuǎn)染miR-93陰性對照物的陰性對照組(SGC-7901-NC組)加入LipofectamineTM3000、Opti-MEM及miR-93陰性對照質(zhì)粒(終濃度100 nmol/L)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染后兩組細胞均在在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2SGC-7901細胞miR-93檢測采用qRT-PCR。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組細胞，用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA。qRT-PCR套裝試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性12 s，62 ℃退火延伸35 s，擴增40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參。引物序列：miR-93上游引物為5′-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3′,下游引物為5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6上游引物為5′-GCACCCGTCCAAGAGAGTC-3′，下游引物為5′-GGTTCCATCCGTACAGCCT-3′。每個反應(yīng)設(shè)3個復孔。miR-93相對表達量用ΔCt表示，升降倍數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93組-ΔCtSGC-7901-NC組。

1.2.3SGC-7901細胞侵襲能力檢測采用Transwell實驗。Matrige1膠用預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基1∶1稀釋后，均勻涂于8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的Transwell小室內(nèi)，37 ℃靜置30 min。收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細胞。分別于Transwell小室的上室接種無血清DMEM培養(yǎng)基重懸的兩組SGC-7901細胞(1×105/mL)懸液200 μL，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transuell小室，用棉簽輕輕擦去小室底部未穿過基底膜的細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下計數(shù)穿過小室基底膜的細胞數(shù)，每個小室隨機選取10個視野進行計數(shù)。

1.2.4兩組SGC-7901細胞遷移能力檢測采用劃痕實驗。實驗分組同前，首先于6孔板背側(cè)每隔0.5 cm用Mark筆劃一橫線，橫穿過孔，每孔至少劃5條線。兩組細胞轉(zhuǎn)染48 h，用微量槍頭(200 μL)垂直6孔板背側(cè)的橫線劃痕。PBS洗去劃下的細胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48 h后取樣拍照，采用Image J 測量細胞覆蓋率，以比較細胞遷移的速度。

1.2.5SGC-7901細胞CHD5 mRNA及蛋白檢測①CHD5 mRNA檢測：采用qRT-PCR。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細胞，用TRIzol抽提各組細胞總RNA。qRT-PCR套裝試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 預變性3 min，95 ℃變性12 s，62 ℃退火延伸35 s，擴增40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參。引物序列：CHD5上游引物為5′-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC-3′，下游引物為5′-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG-3′；β-actin上游引物為5′-CGTGGACATCCGCAAAGA -3′，下游引物為5′-GAAGGTGGACAGCGAGGC-3′。每個反應(yīng)設(shè)3個復孔。CHD5 mRNA相對表達量用ΔCt表示，升降倍數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93組-ΔCtSGC-7901-NC組。②CHD5蛋白檢測：采用Western blotting。分別收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組SGC-7901細胞，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，各取50 μg蛋白上樣,10%的SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，用抗CHD5抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，以α-Tubuli作為內(nèi)參，再用相應(yīng)的二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，PBST洗膜10 min×3 次，配置新鮮發(fā)光液，將膜孵育3min，暗室X線片曝光1-5 min，顯影1 min，定影30 s成像。采用Image lab檢測條帶灰度值，以此表示CHD5蛋白的相對表達量。

2結(jié)果

2.1兩組SGC-7901細胞的miR-93表達比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組SGC-7901細胞的miR-93相對表達量分別為5.37±0.43、9.01±0.61；與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細胞的miR-93表達上調(diào)11.34±2.23倍，兩組相比，P<0.01。

2.2兩組SGC-7901細胞的侵襲能力比較SGC-7901-miR93組穿過小室基底膜的細胞數(shù)為(99.76±10.41)個/HP，SGC-7901-NC組穿過小室基底膜的細胞數(shù)為(56.38±7.82)個/HP，兩組相比，P<0.05。

2.3兩組SGC-7901細胞的遷移能力比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組細胞覆蓋率分別為82.63%±9.14%、48.71%±5.28%，與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細胞的遷移能力提高了43.51%，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組SGC-7901細胞CHD5 mRNA及蛋白表達比較SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組CHD5 mRNA的相對表達量分別為10.01±1.02、9.24±0.89，與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細胞CHD5 mRNA的表達下降了0.39±0.05倍，兩組相比，P<0.05。SGC-7901-miR93組、SGC-7901-NC組CHD5蛋白表達量分別為0.46±0.06、0.25±0.04；與SGC-7901-NC組相比，SGC-7901-miR93組SGC-7901細胞CHD5蛋白表達下降了48.77%，兩組相比，P<0.05。

3討論

miRNAs主要通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)完全或不完全互補來降解靶基因或抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控，參與細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡及增殖等一系列生命活動過程[9]。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a在胃癌組織中的表達量明顯低于癌旁正常組織，同時過表達miR-29a能夠顯著抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。提示miR-29a在胃癌中起著抑癌基因的作用。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-107在肝癌組織及肝癌細胞中的表達量顯著高于癌旁正常組織及正常肝細胞，且過表達miR-107能促進肝癌HepG2細胞增殖，提示miR-107在肝癌中發(fā)揮著癌基因的作用。目前，胃癌的miRNA研究主要應(yīng)用于胃癌早期診斷的分子標志物、分子靶向治療靶點、腫瘤的耐藥性及疾病轉(zhuǎn)歸的預測等方面[12]。Fu等[13]利用qRT-PCR方法檢測胃癌、慢性萎縮性胃炎及健康人群血清中的miR-222，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-222表達量明顯升高，ROC曲線顯示其敏感度66.1%、特異性為88.3%，且Kaplan-Meier生存分析提示血清中miR-222表達量越高的患者，其無病生存率及總生存率越低。Chen等[14]利用qRT-PCR方法檢測158例胃癌組織和癌旁正常組織中的miR-93，發(fā)現(xiàn)128例胃癌組織中miR-93的表達量顯著高于癌旁正常組織，且miR-93的表達與腫瘤的分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著相關(guān)，癌組織中miR-93高表達的患者總生存期及無病生存期均顯著短于低表達者。提示miR-93在胃癌中發(fā)揮著癌基因的作用。本研究采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-93 mimics以上調(diào)miR-93的表達,結(jié)果顯示過表達miR-93能顯著增強SGC-7901細胞的遷移及侵襲能力。這一結(jié)果提示miR-93在胃癌中可能發(fā)揮著類似癌基因的作用。

為了進一步研究miR-93的功能及其在胃癌中的可能作用機制，我們檢索了microRNA.org等生物信息學網(wǎng)站，預測CHD5可能是miR-93的靶基因。CHD5是CHD蛋白家族的第5個成員，是2007年由Bagchi等采用染色體基因工程技術(shù)首次證實的一種抑癌基因，CHD5通過調(diào)控p19arf/p53通路以調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，還可以調(diào)節(jié)ras基因而抑制正常細胞發(fā)生惡變[15]。CHD5在多種惡性腫瘤組織中低表達甚至表達缺失，包括乳腺癌[16]、肺癌[17]及結(jié)直腸癌[18]等。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CHD5基因在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁正常組織，在胃癌的7種細胞系中CHD5基因同樣出現(xiàn)低表達甚至表達沉默；進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達CHD5能夠顯著抑制胃癌細胞的生長，證實了CHD5在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后，其CHD5 mRNA和蛋白表達量均顯著降低。因此，推測miR-93可能通過靶向抑制CHD5的表達在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用。

參考文獻：

[1] Shi Y, Zhou Y. The role of surgery in the treatment of gastric cancer[J]. J Surg Oncol， 2010, 101(8):687-692.

[2] Kiselev FL. MicroRNA and cancer [J]. Mol Biol， 2014,48(2):232-242.

[3] Li C, Ding C, Chen T, et al. Micro ribonucleic acid-93 promotes proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by targeting disabled 2[J]. Thoracic Cancer， 2015,6(4):524-533.

[4] Xu YF, Mao YP, Li YQ, et al. MicroRNA-93 promotes cell growth and invasion in nasopharyngeal carcinoma by targeting disabled homolog-2[J]. Cancer letters， 2015,363(2):146-155.

[5] Jiang L, Wang C, Lei F, et al. miR-93 promotes cell proliferation in gliomas through activation of PI3K/Akt signaling pathway[J]. Oncotarget， 2015,6(10):8286-8299.

[6] Zhao R, Wang N, Huang H, et al. CHD5, a tumour suppressor is epigenetically silenced in hepatocellular carcinoma[J]. Liver Int， 2014,34(6):151-160.

[7] Hall WA, Petrova AV, Colbert LE, et al. Low CHD5 expression activates the DNA damage response and predicts poor outcome in patients undergoing adjuvant therapy for resected pancreatic cancer[J]. Oncogene， 2014, 33(47):5450-5456.

[8] Du X, Wu T, Lu J, et al. Decreased expression of chromodomain helicase DNA-binding protein 5 is an unfavorable prognostic marker in patients with primary gallbladder carcinoma[J]. Clin Transl Oncol， 2013,15(3):198-204.

[9] Farh KK, Grimson A, Jan C, et al. The widespread impact of mammalian MicroRNAs on mRNA repression and evolution[J]. Science， 2005,310(5755):1817-1821.

[10] Liu X, Cai J, Sun Y, et al. MicroRNA-29a inhibits cell migration and invasion via targeting Roundabout homolog 1 in gastric cancer cells.[J]. Mol Med Rep， 2015,12(3):3944-3950.

[11] Zhang JJ, Wang CY, Hua L, et al. miR-107 promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation by targeting Axin2[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015,8(5):5168-5174.

[12] Chen G, Tang Y, Wu JH, et al. Role of microRNAs in diagnosis and treatment of the pathogenesis of gastric cancer[J]. Int J Clin Exp Med， 2014,7(12):5947-5957.

[13] Fu Z, Qian F, Yang X, et al. Circulating miR-222 in plasma and its potential diagnostic and prognostic value in gastric cancer[J]. Medical Oncol, 2014, 31(9):164.

[14] Chen L, Jiang M, Yuan W, et al. Prognostic value of miR-93 overexpression in resectable gastric adenocarcinomas[J]. Acta Gastroenterol Belg， 2012,75(1):22-27.

[15]Bagchi A, Papazoglu C, Wu Y, et al. CHD5 is a tumor suppressor at human p36[J]. Cell， 2007,128(3):459-475.

[16] Wu X, Zhu Z, Li W, et al. Chromodomain helicase DNA binding protein 5 plays a tumor suppressor role in human breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2012,14(3):73.

[17] Zhao R, Yan Q, Lv J, et al. CHD5, a tumor suppressor that is epigenetically silenced in lung cancer[J]. Lung Cancer, 2012,76(3):324-331.

[18] Fatemi M, Paul TA, Brodeur GM, et al. Epigenetic silencing of CHD5, a novel tumor-suppressor gene, occurs in early colorectal cancer stages[J]. Cancer， 2014,120(2):172-180.

[19] Wang X, Lau KK, So LK, et al. CHD5 is down-regulated through promoter hypermethylation in gastric cancer[J]. J Biomed Sci， 2009,16(95):1-6.