陳友興，馮紅超，宋宇峰，舒敏(貴陽醫(yī)學院，貴陽550004;貴陽市口腔醫(yī)院;貴州省食品藥品監(jiān)督局)

口腔鱗癌組織中Slug表達及意義

陳友興1，馮紅超2，宋宇峰3，舒敏1
(1貴陽醫(yī)學院，貴陽550004;2貴陽市口腔醫(yī)院;3貴州省食品藥品監(jiān)督局)

摘要:目的觀察鋅指轉錄因子(Slug)在口腔鱗癌(OSCC)組織中的表達變化，分析其與上皮間質轉化(EMT)特征性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)的關系，探討Slug在EMT中的作用。方法采用免疫組織化學法和原位雜交法檢測42例OSCC組織(觀察組)及12例正?？谇火つそM織(對照組)中Slug、E-cad、Vimentin的表達，比較Slug在兩組中表達的差異性，分析Slug與E-cad及Vimentin的相關性、Slug與OSCC臨床病理因素的相關性。結果觀察組Slug的陽性表達率明顯高于對照組(P＜0.01) ; Slug在OSCC組織中的表達與淋巴結轉移、腫瘤病理分級有關(P均＜0.05)，與OSCC發(fā)病年齡無關; Slug與E-cad的表達呈負相關(r=－3.19，P＜0.05)，Slug與Vimentin的表達呈正相關(r=0.264，P＜0.05)。結論OSCC組織中Slug表達明顯上調，并與E-cad、Vimentin具有相關性，在EMT中具有重要作用，參與了OSCC的發(fā)生、分化及轉移過程。

關鍵詞:口腔鱗癌;鋅指轉錄因子;上皮間質轉化;免疫組織化學;原位雜交

口腔鱗癌(OSCC)是一種宿主易感性與多病因相互作用的一種多過程疾病，與煙草、乙醇、咀嚼檳榔及存在其他呼吸道癌和消化道癌等有關［1］。在惡性腫瘤的發(fā)展進程中，上皮間質轉化(EMT)機制起關鍵作用。EMT能夠使具有極性的上皮細胞轉換為具有移行能力的間質細胞，并獲得高侵襲性和轉移的能力［2］。鋅指轉錄因子(Slug)是Snail家族成員，是EMT的重要調節(jié)因子，其表達往往提示患者預后較差［3］。E-鈣黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)是EMT的特征性蛋白，二者的表達呈負相關。本研究從蛋白質和mRNA水平檢測OSCC組織中Slug的表達，分析Slug的表達與臨床病理因素及E-cad、Vimentin表達的關系，探討Slug因子在EMT中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2008～2014年貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院及貴陽市口腔醫(yī)院收治的OSCC患者42例(觀察組)，其中男25例、女17例，年齡33～78歲、平均59.3歲。均經(jīng)手術病理檢查證實，術前未行放化療、內分泌及生物治療。臨床分期Ⅰ期7例，Ⅱ期8例，Ⅲ期19、Ⅳ期8例;分化程度:高分化26例，中低分化16例;伴淋巴結轉移23例。另外選擇無煙酒嗜好的外傷或正畸拔牙患者12例作為對照(對照組)，其性別、年齡與觀察組具有可比性。

1.2Slug蛋白、E-cad、Vimentin檢測采用免疫組織化學法。取觀察組手術切除的腫瘤組織和對照組正?？谇火つそM織，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸高壓熱修復，加入一抗，4℃過夜，PBS浸洗，加入二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。用已知陽性的卵巢癌切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人Slug單克隆抗體購自博奧森生物(濃度1∶150)，鼠抗人E-cad/vimentin單克隆抗體(濃度1∶100)、二抗免疫組化試劑盒購自北京中杉公司。

1.3Slug mRNA檢測采用原位雜交法。石蠟切片復溫、常規(guī)脫蠟至水。3% H2O2室溫作用10 min，蒸餾水洗3次，胃蛋白酶室溫消化，暴露mRNA核酸片段，加入固定液室溫固定10 min;蒸餾水洗3次，滴加預雜交液，濕盒放入40℃恒溫箱中4 h，滴加雜交液，38～42℃恒溫箱過夜，依次用37℃預溫的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC沖洗，滴加封閉液，37℃孵育30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃孵育60 min，滴加生物素過氧化物酶，37℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替雜交液作為陰性對照。

1.4結果判定

1.4.1人工計分法光學顯微鏡下觀察免疫組化和原位雜交后組織標本的著色程度。Slug蛋白陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細胞核，細胞質中也有表達，Slug mRNA主要表達于細胞質，著色為棕黃色; Vimentin陽性信號定位于胞質內，呈清晰棕黃色顆粒。E-cadherin蛋白陽性染色主要定位于細胞膜，于腫瘤細胞質或細胞核表達＞10%，稱為異位表達;不表達或細胞膜表達＜10%稱為細胞膜表達缺失。異位表達和細胞膜表達缺失統(tǒng)稱為陽性表達，單純細胞膜表達定義為陰性表達。每例切片隨機選擇5個高倍視野，分別按照陽性細胞百分比計分和染色強度計分，陽性細胞數(shù)1～25%為1分，26%～50% 為2分，51%～75%為4分，＞75%為4分;無著色為0分，弱陽性為1分，強陽性為2分。以陽性細胞數(shù)積分乘以染色強度積分，乘積≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.4.2圖像分析法取免疫組織化學和原位雜交法染色的切片，隨機選取5個陽性視野，用Imagepro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)分別檢測陽性細胞的積分光密度和感興趣區(qū)域(AOI)面積，計算平均光密度值。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用四格表χ2或FISH法檢驗，組間比較采用配對t或t'檢驗;相關性分析采用Spearman等級相關系數(shù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組Slug、E-cad、Vimentin表達情況Slug蛋白:觀察組陽性29例(69.0%)，明顯高于對照組的3例(25.0%)，P＜0.01。E-cad:觀察組陽性18例(42.9%)，明顯低于對照組的12例(100%)，P＜0.01。Vimentin:觀察組陽性30例(71.4%)，明顯高于對照組的2例(16.7%)，P＜0.05; Slug mRNA:觀察組陽性25例(59.5%)，明顯高于對照組的1 例(8.3%)，P＜0.05。

2.2兩組Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值觀察組Slug和Vimentin的平均光密度值均高于對照組，E-cad低于對照組(P均＜0.05)。見表1。

表1　兩組Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別　n Slug　E-cadherin　Vimentin觀察組　42　0.264±0.083*0.187±0.048*0.210±0.055*對照組12　0.204±0.026　0.265±0.082　0.161±0.009

2.3OSCC組織中E-cad與Slug表達的關系相關性分析顯示，E-cad與Slug在OSCC中的表達呈負相關(r=－3.19，P＜0.05)，Vimentin與Slug的表達呈正相關(r=0.264，P＜0.05)。

2.4Slug的表達與OSCC臨床病理因素的關系OSCC組織中Slug的表達與其淋巴結轉移、腫瘤分化程度有關(P＜0.05)，與OSCC發(fā)病年齡無關。見表2。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，Slug作為一種抗凋亡劑，參與對乳腺癌局部浸潤的維護，使腫瘤得以生長，并對放療產(chǎn)生失敏感性［4］。對人類胚胎干細胞進行體外分化實驗發(fā)現(xiàn)，Slug能夠抑制E-cad表達，促進Vimentin和基質金屬蛋白酶增加［5］，這與上皮源性的腫瘤轉移機制類似。本研究采用免疫組化方法觀察觀察組中Slug的表達變化，結果顯示，其陽性表達率為78.6% (29/42)，明顯高于對照組，與原位雜交法所得mRNA的表達變化一致。Slug主要定位于腫瘤細胞的細胞核，在少量唾液腺導管上皮中也可見陽性表達，說明在OSCC組織中，Slug可能主要由腫瘤細胞、導管上皮細胞等分泌產(chǎn)生，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中某些生物學行為的調節(jié)有關。本研究顯示，Slug在觀察組中的表達明顯高于對照組，并且與腫瘤的病理分級和淋巴結轉移有關。

EMT是腫瘤轉移的重要機制之一，它是一個高度保守的過程，能夠使靜止的上皮細胞極性消失，失去緊密連接，突破基底膜，成為具有遷移能力的間充質細胞，在上皮源性癌的空間轉移過程中具有重要作用［6］。E-cad是EMT重要的標志蛋白，研究顯示，E-cad表達與OSCC的組織學分級顯著相關，提示E-cad作為一個結構性的關聯(lián)，在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用［7］。Vimentin是所有中間纖維分布最廣的蛋白質，在正常的間充質細胞中廣泛表達，具有維持細胞完整性和抗應力的作用。E-cad與Vimentin是EMT的特征性蛋白，二者表達呈負相關［8］。Vimentin在各種上皮性癌中都有表達，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［9～11］，其過表達與腫瘤的生長、侵襲密切相關。本研究顯示，Slug與E-cad、Vimentin分別呈負相關和正相關關系，表明Slug一定程度上參與了EMT的過程，其可能通過上調腫瘤的侵襲和轉移能力，使之容易出現(xiàn)遠處轉移。腫瘤轉移是一個復雜的過程，腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離并向遠處定植這一過程是通過局部浸潤、血行轉移、細胞增殖等步驟來實現(xiàn)的［12］。在OSCC的發(fā)生發(fā)展中，Slug的表達與E-cadherin、Vimentin具有一定的相關性，在EMT中具有重要作用，其具體機制有待進一步研究。

參考文獻:

［1］趙世祿，程福強，史繁華.口腔鱗狀細胞癌臨床流行病學研究現(xiàn)狀［J］.2013(04) : 1648-49.

［2］Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling，development，and disease ［J］.Cell Biol，2006，172(7) : 973-981.

［3］Merikallio H，T TT，P?kkitaro P，et al.Slug is associated with poor survival in squamous cell carcinoma of the lung［J］.Clin Exp Pathol，2014，7(9) : 5846-5854.

［4］Còme C，Arnoux V，Bibeau F，et al.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression［J］.Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9 (2) : 183-193.

［5］Eastham AM，Spencer H，Soncin F，et al.Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation［J］.Cancer Res，2007，67(23) : 11254-11262.

［6］Ombrato L，Malanchi I.The EMT universe: space between cancer cell dissemination and metastasis initiation［J］.Crit Rev Oncog，2014，19(5) : 349-361.

［7］Zaid KW.Immunohistochemical Assessment of E-cadherin and βcatenin in the Histological Differentiations of Oral Squamous Cell Carcinoma［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(20) : 8847-8853.

［8］Havel LS，Kline ER，Salgueiro AM，et al.Vimentin regulates lung cancer cell adhesion through a VAV2-Rac1 pathway to control focal adhesion kinase activity［J］.Oncogene，2015，34(15) :1979-1990.

［9］Burch TC，Watson MT，Nyalwidhe JO，et al.Variable metastatic potentials correlate with differential plectin and vimentin expression in syngeneic androgen independent prostate cancer cells［J］.PLoS One，2013，8(5) : 65005.

［10］Baldwin LA，Hoff JT，Lefringhouse J，et al.CD151-α3β1 integrin complexes suppress ovarian tumor growth by repressing slug-mediated EMT and canonical Wnt signaling［J］.Oncotarget，2014，5 (23) : 12203-12217.

［11］Kim KH，Kim L，Choi S，et al.The clinicopathological significance of epithelial mesenchymal transition associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Korean J Pathol，2014，48(4) : 263-269.

［12］廖子君，雷光焰.腫瘤轉移學［M］.陜西:陜西科學技術出版社，2007: 14-18.

(收稿日期:2014-12-07)

通信作者:馮紅超

基金項目:貴陽市衛(wèi)生局科技計劃項目［筑衛(wèi)科技合同字(2014)第15號］。

文章編號:1002-266X(2015)18-0070-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R739.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.026