邵力偉，姚春，伍龍，任德發(fā)(江漢大學附屬第二醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院，武漢430050)

環(huán)巴胺抑制Shh信號對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

邵力偉，姚春，伍龍，任德發(fā)
(江漢大學附屬第二醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院，武漢430050)

摘要:目的探討環(huán)巴胺靶向抑制Shh信號對乳腺癌細胞增殖、凋亡以及Survivin表達的影響。方法采用熒光定量PCR法檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織中Shh、PTCH1及GLi1的表達，MTT法檢測不同濃度環(huán)巴胺對人乳腺癌細胞MCF-7增殖抑制的影響，流式細胞術檢測環(huán)巴胺對MCF-7細胞凋亡的影響，Western blot檢測環(huán)巴胺處理前后MCF-7細胞GLi1和Survivin的表達。結果Shh、PTCH1及GLi1在乳腺癌組織中均呈高表達;不同濃度環(huán)巴胺均可抑制MCF-7細胞增殖并誘導其凋亡;環(huán)巴胺處理后GLi1和Survivin的表達均降低。結論Shh信號在乳腺癌組織中呈激活狀態(tài)，靶向抑制Shh信號可抑制乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡，其可能通過抑制Survivin表達發(fā)揮作用。

關鍵詞:乳腺癌; Shh信號;環(huán)巴胺;細胞增殖;細胞凋亡; Survivin蛋白

研究顯示，Shh信號在多種惡性腫瘤中異常激活并與腫瘤的惡性程度密切相關，針對Shh信號通路的靶向治療有望成為治療惡性腫瘤的新途徑［1～3］。凋亡抑制蛋白Survivin是抑制細胞凋亡的重要成分之一，抑制腫瘤細胞中Survivin的表達可起到抑制增殖、促進凋亡的作用［4］。本研究通過檢測乳腺癌細胞中Shh信號分子(Shh、PTCH1、GLi1)的表達情況，進一步利用Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺作用于人乳腺癌細胞系MCF-7，觀察其對乳腺癌細胞增殖、凋亡及Survivin表達的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2008年1月～2012年12月我院收治的乳腺癌手術患者46例，年齡30～69 (42.8±3.1)歲。術前均未接受放化療，術后經病理檢查確診。其中浸潤性導管癌39例、其他7例。TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。術中分別取腫瘤組織和癌旁正常乳腺組織迅速冷凍于液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細胞與試劑人乳腺癌細胞系MCF-7(由武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室自行傳代培養(yǎng))培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。SYBR Premix EX Taq試劑盒購自Invitrogen公司; RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑為美國Gibco公司產品;環(huán)巴胺、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰酶等為美國Sigma公司產品;一抗GLi1、Survivin、GAPDH兔抗人單克隆抗體均購自Cell signaling公司;二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1Shh信號相關蛋白檢測采用實時熒光定量PCR方法。取乳腺癌組織和癌旁正常組織，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，以其為模板進行逆轉錄，合成cDNA第一鏈，－20℃保存?zhèn)溆谩０凑誗YBR試劑盒說明書操作。Shh上游引物: 5'-CCCAATTACAACCCCGACATC-3';下游引物: 5'-TCACCCGCAGTTTCACTCCT-3'。PTCH1上游引物: 5'-TGAGACTGACCACGGCCTG-3';下游引物: 5'-ACCCTCAGTTGGAGCTGCTTC-3'。GLi1上游引物: 5'-GTGCAAGTCAAGCCAGAACA-3';下游引物: 5'-ATAGGGGCCTGACTGGAGAT-3'。內參GAPDH上游引物: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2細胞增殖檢測采用MTT法。將MCF-7以5×104/mL接種于96孔板中，每孔200 μL。在37℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。分別加入5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺，未處理細胞作為對照，每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4h。更換培養(yǎng)液為150 μL的DMSO，震蕩混勻，用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度值。細胞生長抑制率(%)=(對照組吸光度－實驗組吸光度)/對照組吸光度×100%。重復實驗3次取平均值。

1.3.3細胞凋亡檢測將MCF-7消化重懸后，以2 ×105/孔接種于6孔板中，分別加入5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺，未處理細胞作為對照，每組設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。常規(guī)胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，加入Annexin V-FITC和PI避光室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次取平均值。

1.3.4Survivin蛋白檢測采用Western blot法。收集0、5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺處理48 h后的MCF-7細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。常規(guī)封閉、洗膜后加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光顯色。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2　結果

2.1Shh信號在腫瘤組織與癌旁組織中的表達腫瘤組織中Shh、PTCH1和GLi1的表達均顯著高于癌旁組織(P均＜0.01)。見表1。

表1　Shh信號相關蛋白在乳腺癌中的表達(n=3，相對表達量，±s)

注:與腫瘤組織比較，*P＜0.01。

檢測部位Shh　PTCH1　GLI1腫瘤組織0.473±0.324　0.36±0.209　0.296±0.106癌旁組織　1.558±0.431*　0.99±0.202*　2.105±0.700*

2.2不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7增殖的影響MTT實驗結果顯示，5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺均可抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖，其抑制作用具有時間和劑量依賴性。見表2。

表2　不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7增殖抑制率的影響(n=3，%，±s)

組別　MCF-7增殖抑制率24 h　48 h　72 h對照組0.14±0.59　1.58±0.83　3.71±3.34環(huán)巴胺組5 μmol/L　8.73±0.45　10.47±0.70　13.17±0.45 10 μmol/L　18.90±2.95　27.07±4.05　33.20±2.75 20 μmol/L　29.40±6.26　37.83±3.23　38.57±4.52 F 39.942　116.378　82.495 P 0.000　0.000　0.000

2.3不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，0、5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺均可誘導MCF-7細胞凋亡，其凋亡率分別為(1.94± 0.64) %、(11.09±1.65) %、(26.87±0.97) %、(32.56±2.67) %，隨環(huán)巴胺濃度增加，凋亡率明顯增加(P＜0.01)。

2.4不同濃度環(huán)巴胺對Survivin蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，不同濃度環(huán)巴胺均可降低GLi1和Survivin的表達，其作用隨濃度增加而增強。見圖1。

3　討論

研究顯示，多種信號轉導途徑在乳腺癌中呈激活狀態(tài)，靶向抑制這些信號通路可能成為一種新的治療乳腺癌的手段［5］。Shh信號通路在調控胚胎發(fā)育和干細胞分化中具有重要作用，其異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Shh信號通路的關鍵因子包括Shh、PTCH、GLi等，在Hh信號激活時，Hh與PTCH(PTCH1、PTCH2)結合，進一步將信號傳遞給轉錄因子GLi(GLi1、GLi2、GLi3)，后者進入核內，促進基因表達，參與對細胞增殖與凋亡的調控過程。研究表明，在肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌［6］等惡性腫瘤中均存在Shh信號的異常激活。本研究顯示，乳腺癌組織及癌旁正常組織中Shh信號分子Shh、PTCH1和GLi1均呈高表達，與文獻［7～9］報道相符。

本研究使用Shh信號通路的特異性抑制劑環(huán)巴胺體外作用于乳腺癌細胞，觀察不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響。結果顯示，不同濃度環(huán)巴胺均可抑制Shh信號關鍵分子GLi1的表達，且可抑制乳腺癌細胞的增殖并誘導其發(fā)生凋亡。提示體外靶向抑制Shh信號通路可抑制乳腺癌細胞的生長，有望對乳腺癌起到治療作用。

Shh信號激活后可通過作用于多種效應分子來調控腫瘤細胞的增殖與凋亡［10］。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，其在惡性腫瘤中常呈高表達而起到促進增殖和抑制凋亡的作用，采用各種手段抑制腫瘤細胞中Survivin的表達可起到抑制腫瘤生長的作用［11］。本研究顯示，應用環(huán)巴胺抑制Shh信號后，乳腺癌細胞MCF-7中Survivin的表達顯著降低，提示環(huán)巴胺靶向抑制Shh可能是通過抑制Survivin的表達而對乳腺癌細胞起到殺傷作用。

綜上所述，Shh信號在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。應用Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺靶向抑制Shh信號可有效抑制乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡，其可能是通過抑制Survivin的表達發(fā)揮作用。

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(收稿日期:2014-12-31)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0058-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.021