劉俊峰 莫秀梅 孟威威 陳達燦

廣東省中醫(yī)院(廣州 520120)

·學(xué)術(shù)探討·

血清miRNA對中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義*

劉俊峰 莫秀梅 孟威威△陳達燦▲

廣東省中醫(yī)院(廣州 520120)

目的：探討血清miRNA對中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義。方法：分析血清miRNA及中醫(yī)證的特點，miRNA表達的時序性和特異性與證候的動態(tài)變化非常相似，將血清miRNA引入中醫(yī)藥辨證論值得研究領(lǐng)域關(guān)注，從而闡明中醫(yī)證候的實質(zhì)及科學(xué)內(nèi)涵。結(jié)論：血清miRNA可以作為微觀辨證的指標(biāo)與宏觀辨證相結(jié)合提高辯證的準(zhǔn)確性，也可為臨床個體化治療提供重要的指導(dǎo)作用。

miRNA是一類長約21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過堿基配對的方式結(jié)合到靶mRNA的3’端，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達，影響蛋白質(zhì)的合成，是一類十分重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。miRNA不但具有高度保守性、器官組織特異性，而且可以通過精確地調(diào)控靶基因的表達而參與細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)血液中的miRNA的異常表達與多種人類疾病密切相關(guān)，血清miRNA有可能成為疾病診斷、治療及預(yù)后判斷的新興分子生物標(biāo)志物。辨證論治是中醫(yī)認識及治療疾病的最基本原則，也是最具特色的診斷和治療方法，本文主要探討血清中miRNA對辨證及治療的指導(dǎo)作用。

1 血清miRNA 血清miRNA有2種來源，一種是由凋亡細胞或壞死細胞裂解過程中被動滲漏產(chǎn)生的，通常發(fā)生在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移或者慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，由于組織或者細胞破裂，miRNA則從細胞中被動滲漏到血液[1]。另一種是由于細胞微囊泡主動分泌產(chǎn)生的，微囊泡可能是運輸循環(huán)中miRNA的主要載體，在細胞中miRNA首先被裝載入分泌囊泡之中，隨后伴隨微囊泡的分泌而進入循環(huán)系統(tǒng)之中；在細胞培養(yǎng)液和人體外周血液的微囊泡中都含有miRNA。盡管循環(huán)中miRNA的來源尚未完全闡明，循環(huán)血中miRNA是對某種疾病的病理生理過程主動適應(yīng)的介質(zhì)，它們的變化可能在細胞通訊、蛋白轉(zhuǎn)運和調(diào)控免疫細胞功能等多個方面起著重要作用。也有報道血漿室溫放置24h或多次反復(fù)凍融，對血漿中miRNA分子幾乎無影檢測血清中miRNA不僅創(chuàng)傷小、方法簡便，而且結(jié)果準(zhǔn)確較可靠，對于提高疾病診斷、分類及預(yù)后的精度有重要作用。miRNA已具備了疾病生物標(biāo)志物的特點。目前為止，血清miRNA表達譜的檢測技術(shù)已經(jīng)成熟。因此，血清miRNA有望成為疾病診斷、治療和預(yù)后判斷的新興分子生物標(biāo)志物。

2 miRNA與中醫(yī)證之間的關(guān)系 證候研究是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的一個至關(guān)重要的科學(xué)問題。中醫(yī)的“證”是指在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有內(nèi)在聯(lián)系，且能夠反映疾病過程中某一特定階段的病理病機，也是機體對致病因素反應(yīng)的一種功能狀態(tài)。中醫(yī)證候包括證候病機和與其密切相關(guān)的癥候群兩個部分，具有抽象與具體的雙重特性，而且證候的發(fā)生與發(fā)展是一個動態(tài)變化的過程，蘊涵著不同的層次、變量和時相性等多維特征，具有整體性、傳變性、時空性及個體差異性等特點?！坝兄T內(nèi)必形諸外”，證候體現(xiàn)了從分子、細胞及組織器官的動態(tài)演變。隨著miRNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明miRNA具有2大特征，首先，在不同組織、器官、細胞的生長發(fā)育過程中，miRNA 表達譜存在很大差異，揭示了 miRNA 的表達具有時序特異性與組織特異性；另外，每種 miRNA 有多個潛在靶基因；對于不同細胞或者同一細胞的不同狀態(tài)，某一特定 miRNA可調(diào)控的靶標(biāo)是不完全相同的，是動態(tài)變化的，揭示了miRNA 的表達具有時空動態(tài)變化的特性[2]。

中醫(yī)的“證”有即時性與差異性的特點，因為其是某一階段的情況，所以會處于不斷的動態(tài)變化之中；miRNA具有精確特異的時空表達特點，參與很多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，二者有相似的特性。miRNA及其表達的動態(tài)變化過程與臨床表現(xiàn)的癥狀和體征有內(nèi)在的聯(lián)系，其可能參與了證候的發(fā)生與動態(tài)變化。

3 血清中miRNA在中醫(yī)證型研究中的應(yīng)用 目前，循環(huán)中的miRNA與中醫(yī)證型的研究還比較少，仍處于初步探索階段。Zhang[3]等研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝辨證為肝膽濕熱證和肝腎陰虛證患者的血清中miR-583、miR-663、miR-1299的量明顯高于正常對照組，而且肝膽濕熱證患者的血清中miR-583、miR-663的量明顯高于肝腎陰虛證組和正常對照組，由此可以推斷miR-583、miR-663可作為慢性乙肝不同證型的生物標(biāo)記物。Chen等[4]進一步對慢性乙肝辨證屬肝膽濕熱證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證患者血清中的miRNA進行分析，研究表明3種中醫(yī)證型患者血清中的miRNA表達譜明顯不同，隨后采用Pathway和GO功能分析研究表明慢性乙肝的3種證型分子機理也不相同，其中虛實夾雜證(肝郁脾虛證)與虛證(肝腎陰虛)本質(zhì)上并不是接近的，而且二者較實證(肝經(jīng)濕熱證)更加復(fù)雜，虛實夾雜證較虛證發(fā)展為癌癥進程的風(fēng)險更高，研究同時表明血清中部分miRNA可能是由實證轉(zhuǎn)化為虛證過程中的重要介質(zhì)。以上研究表明將宏觀辨證與微觀辨證結(jié)合起來探討證候的演變規(guī)律對中醫(yī)辨證有一定的指導(dǎo)意義。

馮知濤[5]等將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者分為風(fēng)濕夾瘀型和肝腎虧虛型，研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕夾瘀型患者外周血miR-146a、miR-16水平高于肝腎虧虛型，紅細胞沉降率(ESA)及C反應(yīng)蛋白(CRP)也高于肝腎虧虛型，而類風(fēng)濕因子(RF)低于肝腎虧虛型。風(fēng)濕夾瘀型RA患者外周血miR-146a、miR-16的表達水平和ESR、CRP、RF等指標(biāo)可為RA患者的辨證分型提供客觀的參考。因此血清miRNA與疾病相關(guān)的實驗室指標(biāo)相結(jié)合可以作為中醫(yī)辨證過程中潛在的分子標(biāo)記物。

除了血液中的miRNA與中醫(yī)的證有關(guān)外，研究表明唾液中及腫瘤組織中的miRNA與中醫(yī)的證也有密切關(guān)系。SongGao[6]等研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者唾液中一些特異的miRNA與中醫(yī)證存在密切關(guān)系，結(jié)果顯示miR-17、miR-21、miR-181b在濕熱證中特異性表達，miR-196a在脾虛證中特異性表達，意味著miRNA在不同的證中發(fā)揮著不同的作用，這一研究在一定程度上也揭示miRNA可以作為中醫(yī)證的分子標(biāo)記物。李立平等[7]研究發(fā)現(xiàn)“脾胃濕熱型”患者胃癌組織miR-449相對表達量明顯低于其它證型，揭示了胃癌濕熱之邪與miRNA的相關(guān)性。

4 中醫(yī)藥對血液中miRNA水平的調(diào)控研究 Chao Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)脾腎虧虛型重癥肌無力患者血清存在87個異常的miRNA表達譜，其中42個miRNA的表達高于正常對照組，45個miRNA低于正常對照組，采用中藥健肌寧治療后不但可以改善重癥肌無力患者癥狀，而且45個低水平的miRNA中有43個明顯上調(diào)，42個高水平miRNA中有35個出現(xiàn)下調(diào)，進一步采用生物信息學(xué)方法對miRNA表達譜及靶基因分析，發(fā)現(xiàn)血清中17個miRNAs的變化以及一些免疫細胞凋亡通路的抑制作用是中藥健肌寧療效的部分作用機制。以上研究表明，中醫(yī)藥可通過直接或間接對miRNA的調(diào)控從而起到治療作用，進一步對結(jié)果采用統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)進行分析，得到方劑起效的相關(guān)miRNA表達譜，進而從miRNA水平揭示中醫(yī)藥治病的作用機制。

此外，有研究報道血清/血漿中miRNA還可反映肝臟損傷情況，用高濃度對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損后發(fā)現(xiàn)血漿miR-22、miR-101b、miR-122及miR-192的表達與小鼠肝臟損傷呈時間及劑量依賴關(guān)系，而以血漿miR-122及miR-192作為分子標(biāo)志物比用肝臟酶學(xué)指標(biāo)評價肝臟損傷更敏感[9]。

5 血清中miRNA對中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義

5.1 宏觀與微觀辨證結(jié)合，提高中醫(yī)辨證的準(zhǔn)確性 血清的清潔、無創(chuàng)、快速的特性使血清中miRNA在各類疾病生物標(biāo)記物研究中優(yōu)勢明顯。對中醫(yī)而言，證候是研究的瓶頸，目前研究發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型患者血清miRNA的表達不同，對于中醫(yī)的辨證已經(jīng)出現(xiàn)整體與血清miRNA或者與其它實驗室等微觀指標(biāo)相結(jié)合的系統(tǒng)性研究。微觀辨證可彌補宏觀辨證的不足，這種思路有助于辨證的客觀性和準(zhǔn)確性，從而指導(dǎo)臨床的處方用藥。此外，將血清miRNA引入中醫(yī)辨證論治的研究體系中，使用芯片技術(shù)及生物信息學(xué)，通過建立與證候有關(guān)的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，很有可能從轉(zhuǎn)錄后水平闡明 “中醫(yī)證”本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵。

5.2 血清miRNA可作為中醫(yī)藥療效預(yù)測的生物標(biāo)記物 21世紀(jì)臨床醫(yī)學(xué)的特征是個體化醫(yī)療，其本質(zhì)就是基于生物標(biāo)志物的醫(yī)療選擇。對于一些具有異質(zhì)性的疾病而言，由于個體差異較大，不同的個體對于同一治療的反應(yīng)也不同，對于中醫(yī)藥治療療效確切的疾病，將患者血清miRNA或者與其它實驗室指標(biāo)結(jié)合作為療效預(yù)測的生物標(biāo)記物，在臨床過程中將患者分層，實施個體化治療，提高臨床療效的同時，做到科學(xué)、合理、安全的用藥。目前采用血清miRNA作為中醫(yī)藥療效預(yù)測的生物標(biāo)記物尚未見相關(guān)的研究報道，這也是以后的研究方向。明確中醫(yī)不同證型患者血清miRNA表達譜的不同以及中醫(yī)藥療效預(yù)測的生物標(biāo)志物，可為最終實現(xiàn)個體化治療奠定基礎(chǔ)。

[1] Zen K，Zhang CY. Circulating microRNAs：a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers[J].Med Res Rev，2012，32：326-348．

[2] 李 潔，秦性良，邵寧生.microRNA及其靶基因的時空特異性與動態(tài)變化[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2013，40(7)：617-626.

[3] Hui Zhang，Yan Guan，Yi-Yu Lu，et al. circulating mir-583 and mir-663 refer to zheng differentiation in chronic hepatitis B[J]．Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume，2013：751341.

[4] Chen QL，Lu YY，Zhang GB，et al.Characteristic Analysis from Excessive to Deficient Syndromes in Hepatocarcinoma Underlying miRNA Array Data[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013：1-8.

[5] 馮知濤，李 娟，任 潔.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a、miR-16的表達水平及臨床指標(biāo)與中醫(yī)證型的關(guān)系探討[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11 (11)：1226-1229.

[6] Gao S，Chen LY，Wang P，et al.MicroRNA Expression in Salivary Supernatant of Patients with Pancreatic Cancer and Its Relationship with ZHENG[J]. Biomed Res Int，2014：1-8.

[7] 李立平，吳煒景，邱 嫻，等.廣東地區(qū)胃癌患者中醫(yī)臨床證候分型與miR-449表達相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(12)：2695-2698.

[8] Jiang C，Liu P，Zhang J ，et al.Clinical Study of Effects of Jian Ji Ning ，a Chinese Herbal Medicine Compound Preparation，in Treating Patients with Myasthenia Gravis via the Regulation of Differential MicroRNAs Expression in Serum[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014：1-14.

[9] Wang K，Zhang S，Marzolf B，et al.Circulating microRNAs，potentional biomarkers for drug-induced liver injury. [J] Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(11)：4402-7.

(收稿2015-02-03；修回2015-03-16)

*廣東省財政廳課題[粵財工(2013)]

△廣州中醫(yī)藥大學(xué)( 廣州 510405)

▲通訊作者

血清/診斷 miRNA 辨證論治

R242

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.065

廣東省中醫(yī)藥管理局課題(20142066)

廣東省中醫(yī)藥強省建設(shè)專項中醫(yī)優(yōu)勢病種突破項目[粵財社(2014953)]