謝敏 姜法貴 郭燕君

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，浙江 嘉興 314001)

卵泡發(fā)育和閉鎖過程中顆粒細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)系的研究*

謝敏1姜法貴1郭燕君2Δ

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，浙江 嘉興 314001)

自噬是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一些損壞的細(xì)胞器或未折疊蛋白被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體中進(jìn)行降解的過程，也是細(xì)胞自身修復(fù)和維持生命的重要過程。凋亡則是指生理或病理條件下，細(xì)胞受內(nèi)在遺傳機制調(diào)控而自動結(jié)束生命的過程。研究表明，凋亡與自噬現(xiàn)象共同存在于與卵泡發(fā)育和閉鎖過程密切相關(guān)的顆粒細(xì)胞中，但二者的相互聯(lián)系尚不十分清楚。文章總結(jié)了自噬與凋亡在卵泡發(fā)育和閉鎖中的不同作用，并從二者在顆粒細(xì)胞的交叉對話的角度概括了它們之間的關(guān)系。

凋亡；自噬；顆粒細(xì)胞；卵泡發(fā)育；閉鎖

顆粒細(xì)胞(Granulosa cell，GC)是卵巢中一類十分重要的細(xì)胞，它位于卵母細(xì)胞透明帶的外側(cè)，通常有多層，通過縫隙連接與卵母細(xì)胞相連，在卵母細(xì)胞體內(nèi)、外成熟過程中起著重要的作用[1]。二者關(guān)系密切：卵母細(xì)胞指導(dǎo)顆粒細(xì)胞的增殖、分化；顆粒細(xì)胞的功能狀態(tài)會影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和隨后胚胎的發(fā)育潛能[2]。哺乳動物卵巢中存在普遍的卵泡閉鎖現(xiàn)象。由于卵泡閉鎖時個體年齡及卵泡發(fā)育階段各不相同，形成閉鎖的具體過程也不盡一樣。但在閉鎖卵泡超微結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)卵泡細(xì)胞中存在核固縮、胞漿出現(xiàn)空泡、形成閉鎖小體等凋亡形態(tài)的改變，這些變化首先發(fā)生在顆粒細(xì)胞中。因此，現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為卵泡閉鎖實質(zhì)就是卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的結(jié)果。最近，研究發(fā)現(xiàn)LC3蛋白在大鼠卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)最高，這表明，自噬作用主要發(fā)生在顆粒細(xì)胞，自噬使顆粒細(xì)胞死亡可能參與卵泡閉鎖[3]。

1 顆粒細(xì)胞自噬和凋亡在卵泡發(fā)育、閉鎖中的作用

目前認(rèn)為，細(xì)胞死亡包括3種類型: 壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death)是選擇性的清除生物體內(nèi)醫(yī)學(xué)無用的及危險的細(xì)胞。依據(jù)形態(tài)學(xué)劃分為凋亡和自噬兩種形式。生理條件下，凋亡依賴Caspase參與，染色體濃聚、細(xì)胞皺縮、DNA降解和凋亡小體形成等特征，清除單個細(xì)胞最終被巨噬細(xì)胞發(fā)生通過內(nèi)吞作用后，再由溶酶體執(zhí)行講解功能。自噬以自噬體的出現(xiàn)為特征，是一種在進(jìn)化上保守的真核細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運泡的運輸機制。自噬可以將亞細(xì)胞成分如胞質(zhì)、細(xì)胞器和蛋白通過自噬體與溶酶體中的水解酶進(jìn)行降解，消化后的產(chǎn)物可以進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)[4,5]。

卵泡發(fā)育是一個連續(xù)的變化過程，一般可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡。原始卵泡在無外界刺激的情況下增殖和發(fā)育時，只有少數(shù)發(fā)育，其余保持靜止?fàn)顟B(tài)。啟動卵泡生長需要卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，還需來自顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)因子的作用[6]，卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞-膜細(xì)胞通過相互作用，調(diào)節(jié)卵泡生長[7]。卵母細(xì)胞產(chǎn)生的生長分化因子(Growth differentiation factor-9，GDF-9)通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡和抑制卵泡閉鎖，促進(jìn)卵泡的生存和增殖；同時GDF-9通過上調(diào)膜細(xì)胞雄性激素的含量促進(jìn)腔前卵泡(Preantral follicle)的生長。在卵母細(xì)胞中敲除GDF-9，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的增殖下降，出現(xiàn)異常的卵母細(xì)胞生長，并且卵泡不能發(fā)育到次級卵泡階段。另外，下調(diào)GDF-9的表達(dá)，可以促進(jìn)caspase-3的活化和顆粒細(xì)胞的凋亡。膜性因子EGF、TGF-a、KGF和BMP-7促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[8]。

人類早期生長階段的初級卵泡和次級卵泡顆粒細(xì)胞的增殖顯著(在數(shù)量和尺寸上迅速增長)，顆粒細(xì)胞層數(shù)逐漸增多，顆粒細(xì)胞間出現(xiàn)一些小腔隙，并逐漸融合成卵泡腔。在FSH作用的基礎(chǔ)上，經(jīng)黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)的刺激，次級卵泡發(fā)育為成熟卵泡。卵巢內(nèi)的多數(shù)卵泡發(fā)育到一定的階段后停止發(fā)育并且退化，發(fā)生卵泡閉鎖現(xiàn)象。大多數(shù)哺乳動物的卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目會隨年齡的增長不斷減少，在哺乳動物的卵巢中，只有一小部分的卵泡成熟后參與排卵。出生10天后的小母豬的雙側(cè)卵巢中，大約有500萬個原始卵泡(牛、羊和小鼠的卵巢中分別有120萬、110萬和100萬個原始卵泡)[6,9]。但生育期的母豬，最后參與排卵的卵母細(xì)胞不超過1 600個，少于全部初級卵母細(xì)胞的0.14%，其他均閉鎖、退化;新生兒兩側(cè)卵巢有70萬～200萬個原始卵泡，7～9歲時約30萬個，青春期開始時為4萬個，40～50歲時僅有幾百個，大量卵泡均先后閉鎖[10]。卵泡閉鎖是卵母細(xì)胞質(zhì)量選擇的一個重要的、正常的生理過程，自噬和細(xì)胞凋亡可能參與調(diào)節(jié)卵巢卵泡的發(fā)育和閉鎖[3,8]。

自噬和凋亡存在著差異，有研究發(fā)現(xiàn)自噬與凋亡存在著分子聯(lián)系。在死亡受體和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中，Beclin-1是Caspase-3、-7、-8的剪切對象[12]。細(xì)胞凋亡和自噬被認(rèn)為是代表細(xì)胞死亡機制的連續(xù)部分：自噬為凋亡所必需，自噬先于凋亡，進(jìn)而促進(jìn)凋亡；或自噬抑制凋亡，如在腫瘤細(xì)胞中自噬使凋亡率下降[13]；再或者自噬與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞死亡，抑制其中之一都會轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N細(xì)胞死亡途徑[14,15]。在任何情況下，積累自噬體都是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵過程。Western blot分析表明，剛出生的雌性動物會經(jīng)歷一個由自噬介導(dǎo)而使卵泡閉鎖加快的過程，凋亡卻在其后的卵泡閉鎖過程中占優(yōu)勢，因此卵巢卵泡的發(fā)育和閉鎖過程可能包括凋亡和自噬兩方面[8,16]。

青春期前大鼠卵母細(xì)胞體外分離，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞至少表達(dá)Caspase-3，Lamp1， LC3三者其中之一。卵母細(xì)胞Annexin-V陽性或者M(jìn)DC陽性。然而，大多數(shù)卵母細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)記物都顯示陽性反應(yīng)。在不同的年齡段，卵母細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)記物同時呈陽性反應(yīng)的相對比例不變。在所有的卵母細(xì)胞中都存在LC3-I轉(zhuǎn)化成LC3-II、Caspase-3、 Lamp1、LC3的mRNA都存在。結(jié)果顯示從新生到青春期前大鼠的卵母細(xì)胞呈三種不同的細(xì)胞死亡過程：凋亡，自噬和兩個細(xì)胞死亡的途徑參與的混合死亡方式[17]。Choi JY研究大鼠顆粒細(xì)胞自噬在卵泡發(fā)育和閉鎖中的作用發(fā)現(xiàn)，在卵泡形成過程中，自噬主要在顆粒細(xì)胞中誘導(dǎo)，而且與凋亡顯示了很好的相關(guān)性[18]。顆粒細(xì)胞亞型以自噬或細(xì)胞死亡的方式來影響oxLDL依賴LOX-1的活化和TLR4[19]。在人類顆粒細(xì)胞LOX-1和凋亡的調(diào)節(jié)依賴氧化應(yīng)激，當(dāng)衰老和肥胖時，其變得過多，因為彌補自噬減弱的能力和抗氧化的效能降低[20]。在人類卵巢Beclin 1，Bcl-2結(jié)合自噬相關(guān)蛋白免疫定位，可能與黃體的壽命有關(guān)系[21]。

2 顆粒細(xì)胞自噬和卵泡閉鎖

大鼠顆粒細(xì)胞通過自噬體的聚集誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡研究發(fā)現(xiàn)，聚集的自噬體通過減少bcl-2表達(dá)和減少隨后的Caspase激活來誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡[3]。卵泡閉鎖可能與細(xì)胞的凋亡有關(guān)，顆粒細(xì)胞是細(xì)胞凋亡的主要靶細(xì)胞，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞自噬，與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[18]。在卵泡閉鎖的早期階段，Beclin-1主要定位在顆粒細(xì)胞中，然而Caspase-3的表達(dá)是離散的：在魚類卵泡閉鎖的進(jìn)展期，即使Beclin-1的信號偏高，Caspase-3仍有明顯的表達(dá)：在卵泡閉鎖的晚期， Caspase-3在剩余閉鎖卵泡的細(xì)胞中表達(dá)水平較高[22]。

LC3蛋白在大鼠卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)最高，這表明自噬作用主要發(fā)生在顆粒細(xì)胞，自噬使顆粒細(xì)胞死亡可能參與卵泡閉鎖[3]。用血清饑餓法體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，觀察其自噬體，發(fā)現(xiàn)用10 mmol·L-13-MA 處理過的顆粒細(xì)胞中自噬體數(shù)量減少，具體機制是3-MA通過抑制class III PI3K的活力來抑制自噬體的形成[23]：與此相反，當(dāng)用0.1 mmol·L-1Baf A 1處理顆粒細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)眾多的自噬體，Baf A1可以通過減少自噬體與溶酶體的融合而引起自噬體的積累[24]。然而，雖然在大鼠顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到了自噬體的積累，但細(xì)胞的死亡率和凋亡率，并不高于用3-MA處理過的顆粒細(xì)胞的死亡率和凋亡率，表明在血清不足的條件下，自噬體在顆粒細(xì)胞中的積累并不足以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡。而在血清不足的情況下抑制HeLa細(xì)胞中的溶酶體[25]，積累大量的自噬體可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明自噬體積累到一定的水平，可能會促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡[3]。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)典型的自噬現(xiàn)象，如在細(xì)胞內(nèi)存在多個自噬空泡[18]，說明在無血清條件下存在顆粒細(xì)胞自噬現(xiàn)象。非洲刺毛鼠有腔卵泡發(fā)生閉鎖的過程較緩慢，Szotys等[26]的研究表明，這與顆粒細(xì)胞的成熟狀態(tài)有關(guān)，未分化的比成熟的顆粒細(xì)胞更多地發(fā)生凋亡。

使用3-MA處理過的大鼠顆粒細(xì)胞，Bax和Bcl-2的表達(dá)水平并沒有變化，但是用Baf A1處理過的顆粒細(xì)胞的Bcl-2的表達(dá)水平下降，表明Bcl-2的表達(dá)水平下降明顯與自噬體的積累進(jìn)而誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。由Baf A1誘導(dǎo)的自噬體的積累，使活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)水平都有顯著的增加，表明自噬體的積累增加顆粒細(xì)胞的凋亡，是通過降低Bcl-2的表達(dá)水平和隨后Caspases的活化，再通過活化Caspases進(jìn)一步降低Bcl-2的表達(dá)水平，最終使自噬體積累，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡[3]。

普通豬和小型豬在卵泡發(fā)育方面有很大的不同， 如具有不同的排卵和黃體化模式。自噬對這兩種豬中的顆粒細(xì)胞的調(diào)控也不同。用雷帕霉素處理普通豬和小型豬體外培養(yǎng)的卵泡，發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A(MAP1LC3A)和自噬蛋白5(ATG5)在顆粒細(xì)胞中有較強的表達(dá)，并且藥物處理后效果更顯著。此外，無論有無雷帕霉素處理，普通豬卵泡中的MAP1LC3A和ATG5表達(dá)水平都高于小型豬。用雷帕霉素處理小型豬的顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素提高LC3A-I和LC3A-II的水平：而相同的處理普通豬顆粒細(xì)胞，LC3A-I水平上升，LC3A-II水平下降，說明自噬在調(diào)節(jié)豬卵泡細(xì)胞重塑系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[27]。在正常豬和小型豬中囊狀濾泡中MAP1LC3A的表達(dá)是不一樣的，這種觀點可以解釋小型豬獨特的卵泡發(fā)育特征。

用oxLDL處理體外培養(yǎng)的人類顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)6 h后大約有30%的細(xì)胞MAP LC3陽性?？扇苄问絃C3-I、LC3-II分子的表達(dá)變化情況并不明顯；顆粒細(xì)胞的中間絲、微管等細(xì)胞骨架成分也參與形成自噬體[28]。處理12 h后，未發(fā)現(xiàn)LC3-I和LC3-II表達(dá)變化[28]。這些結(jié)果表明人類顆粒細(xì)胞經(jīng)過oxLDL的處理會發(fā)生自噬現(xiàn)象， 用電子顯微鏡也發(fā)現(xiàn)了大量自噬泡的存在。

羅嘉等研究卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)治療患者卵丘顆粒細(xì)胞自噬活性及凋亡水平對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞凋亡及自噬能力參與卵母細(xì)胞的成熟及受精過程，并對卵母細(xì)胞成熟度過程起到調(diào)控作用[29]。細(xì)胞凋亡率越高，自噬水平越差的患者，其卵母細(xì)胞發(fā)育水平越差，受精能力越差[30]。隨著Dale 胚胎評分的增加，細(xì)胞凋亡及自噬可影響胚胎質(zhì)量；細(xì)胞凋亡越高，自噬能力也差的患者其胚胎質(zhì)量越差，受孕幾率越低。對于受孕成功的患者也可能出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等情況，從而影響患者妊娠結(jié)局。卵丘顆粒細(xì)胞自噬活性及凋亡水平可影響卵子的成熟度、質(zhì)量、受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局。申春艷研究顯示：Smad3基因特異的SiRNA及真核表達(dá)質(zhì)?？梢杂行У剞D(zhuǎn)入大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中，Smad3基因促進(jìn)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬，其機制可能與Bcl-2蛋白相關(guān)。

自噬在哺乳動物在胚胎發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用，在體外成熟誘導(dǎo)自噬可以提高豬卵母細(xì)胞核和胞漿成熟，自噬的化學(xué)誘導(dǎo)劑rapamycin處理豬卵母細(xì)胞體外成熟中對核和胞漿的影響后發(fā)現(xiàn)增加LC3-II表達(dá)MII期卵母細(xì)胞的比例增高，顯著提高核成熟。其胞漿成熟標(biāo)記物p34cdc2激酶和單精受精率要高。在囊胚胚胎中，1 nM rapamycin處理組抗凋亡Bcl-xL轉(zhuǎn)錄增加，雖然凋亡前Bax轉(zhuǎn)錄水平減少。結(jié)果顯示IVM中誘導(dǎo)自噬有助于提高豬卵母細(xì)胞核和胞漿的成熟[31]。自噬是一個重要的細(xì)胞過程，自噬作為泛素系統(tǒng)和降解長壽蛋白質(zhì)、細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的同伴途徑。雖然最初表現(xiàn)為酵母，但是，自噬已經(jīng)被認(rèn)為是影響哺乳動物發(fā)育和疾病的一個重要機制。Becn1是大家公認(rèn)的腫瘤抑制基因，在人類40-75%的乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中顯示，Becn1基因雜合性喪失。因為Becn1自噬的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過條件敲出小鼠的方法來設(shè)法研究Becn1基因在雌性生殖中的作用，發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞缺乏Becn1基因的孕鼠，孕酮產(chǎn)生缺陷，隨后早產(chǎn)表型。Becn1基因敲除模型鼠的黃體細(xì)胞自噬缺陷以及類固醇生成所需積累脂滴的缺陷?？傊?，在哺乳動物生殖過程中Becn1在卵泡中提供重要的功能[32]。

在小鼠卵母細(xì)胞玻璃化溫過程中自噬是否被誘導(dǎo)，MII期卵母細(xì)胞玻璃化儲存在液氮中至少2周，RT-PCR分析幾個自噬基因如Atg5，Atg7，Atg12，LC3a，LC3b，Beclin1在MII期卵母細(xì)胞中表達(dá)。Atg7和Atg12在mRNA水平有輕微減少，Atg7和Atg12基因表達(dá)沒有影響?；罴?xì)胞激光共聚焦分析顯示GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠來源的卵母細(xì)胞顯示玻璃化溫的卵母細(xì)胞比新生的卵母細(xì)胞相比，GFP-LC3點狀表達(dá)顯著增高。玻璃化溫的卵母細(xì)胞BECLIN1蛋白也增加。給予自噬抑制劑3-MA后，并不能顯著地影響卵母細(xì)胞生存率，試管受精率和溫化及試管受精后胚胎的發(fā)育率。玻璃化溫的卵母細(xì)胞中自噬的激活是一種自然的對冷應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)[33]。

3 調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞自噬和凋亡的相關(guān)因子和信號通路

與顆粒細(xì)胞自噬相關(guān)的信號通路研究較多的是PI3K/PKA/mTOR通路。在體，注射促性激素后，大鼠顆粒細(xì)胞中LC3-II表達(dá)抑制，p-AKT和p-S6K表達(dá)增加。通過代謝清除促性激素后，LC3-II表大增加，p-AKT和p-S6K表達(dá)減少。此外，體外給予大鼠顆粒細(xì)胞FSH也能抑制LC3-II表達(dá)，隨后伴隨著p-AKT和p-S6K表達(dá)增加。AKT抑制劑VIII抑制AKT磷酸化后，抑制FSH介導(dǎo)的S6K磷酸化，LC3-II表達(dá)增加。將FSH和AKT抑制劑一起添加與單獨添加FSH相比，增加了凋亡的水平和顆粒細(xì)胞的死亡?？傊诼雅莅l(fā)育中，AKT介導(dǎo)的mTOR激活抑制顆粒細(xì)胞自噬，參與凋亡性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)[35]。瘦素樣低密度脂蛋白受體-1介導(dǎo)人類顆粒細(xì)胞自噬，可作為程序性細(xì)胞死亡的一個旁路[36]。模型鼠香煙煙霧暴露通過卵巢細(xì)胞死亡旁路路徑導(dǎo)致卵泡損失研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露不能誘導(dǎo)凋亡，但是能激活A(yù)tg信號通路，最終導(dǎo)致卵巢卵母損失。我們進(jìn)一步推測Atg可能是毒物誘導(dǎo)卵巢卵泡損失的一個新機制[37]。

4 展望

自噬和凋亡發(fā)生在任何發(fā)育階段的卵泡中，在卵泡發(fā)育的各個階段，自噬可能在卵巢卵泡發(fā)育過程中直接決定卵泡的命運(閉鎖或是排卵)，但是目前有關(guān)自噬在卵巢發(fā)育過程中作用的研究報道非常少，眾多的具體機制并沒有完全被闡明，值得深入研究。自噬因與凋亡之間的復(fù)雜交互作用而撲朔迷離。全面理解自噬與凋亡的交互作用及分子機制是目前研究面臨的主要挑戰(zhàn)。究竟二者之間如何對話共同決定細(xì)胞的命運？甚至二者與其它細(xì)胞死亡方式如程序性壞死如何實現(xiàn)共同作用？相信通過在細(xì)胞、動物模型及人類疾病樣本上的動態(tài)研究，探索已知的影響卵泡發(fā)育和閉鎖的途徑與自噬間的關(guān)系，不僅將加深對卵泡發(fā)育機制的認(rèn)識，同時也將為卵巢早衰、卵巢癌等的深入研究奠定基礎(chǔ)，研究結(jié)果將為女性不孕不育的原因探索提供理論依據(jù)。

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Relationship between granulosa cells autophagy and apoptosis in the process of follicular development and atresia*

Xie Min1，Jiang Fa-gui，Guo Yan-jun2△

(Department of Anatomy, School of Medicine, Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314001)

嘉興市科技局課題(編號：2013AY21046)；浙江省大學(xué)生科研創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目(2015R417003)；嘉興學(xué)院2014年一般SRT資助項目

謝敏，女，嘉興學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)五年制學(xué)生，Email：1729906421@163.com。

Δ通訊作者：郭燕君，女，講師，主要從事生殖生物學(xué)研究，Email：yanjun_guo@163.com。

2015-4-8)