康敏 任美萍 趙磊 鄧明明 李昌平

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥品與功能性食品中心，四川 瀘州 646000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150081)

論 著

積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力和凋亡影響*

康敏1任美萍2△趙磊3鄧明明1李昌平1

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥品與功能性食品中心，四川 瀘州 646000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150081)

目的：觀察積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力和凋亡的影響。方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法(CCK-8)檢測不同濃度的積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖影響；細(xì)胞黏附試驗(yàn)檢測細(xì)胞體外黏附能力的變化，Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞體外侵襲能力的變化，流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：積雪草苷明顯抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖，積雪草苷處理后人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力分別下降到61.2%，47.6%，38.6%；侵襲能力分別下降到42.3%，31.7%，21.6%；AnnexinV/PI雙染法檢測顯示積雪草苷可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株凋亡，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：積雪草苷能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞株的增殖，抑制其體外粘附和侵襲能力，誘導(dǎo)其凋亡。

積雪草苷；胃癌；凋亡；轉(zhuǎn)移

胃癌是目前致死率位居所有腫瘤致死率第二位的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。胃癌可以通過手術(shù)藥物治療等方式進(jìn)行治療，但轉(zhuǎn)移率高，胃癌死亡主要與胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，免疫應(yīng)答、機(jī)體免疫功能下降，新血管增生等可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。中藥能提高機(jī)體免疫力，抑制腫瘤生長，能否從中藥中尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效藥物是目前研究的一個(gè)方向。積雪草苷(Asiaticoside，AS)是從傳統(tǒng)中草藥積雪草中提取出的一種生物堿，以往研究主要集中在AS抗炎、抗氧化、抗衰老的治療上[2]，目前研究顯示積雪草苷也具有抗腫瘤活性，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)積雪草苷對(duì)人肝癌細(xì)胞株，胃癌細(xì)胞株，S180等腫瘤均有誘導(dǎo)凋亡作用[3]。但目前積雪草苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)移能力有無影響目前尚不清楚。據(jù)此本研究通過觀察積雪草苷干預(yù)后對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的浸潤和粘附以及凋亡的影響，為積雪草苷用于防治胃癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

積雪草苷(成都普斯生物科技有限公司，純度98%，溶于DMSO中，終濃度低于1‰)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；AnnexinV-FITC試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國)；Transwell小室(Costar Cambridge公司，美國)；Matrigel膠(BD公司，美國)；人胃癌SGC-7901細(xì)胞株(上海拜力生物試劑有限公司，中國)。

1.2 儀器

CKX41型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；MCO-15A型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；550型酶標(biāo)儀(bio-rad，美國)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司，SBK-YLQX-003552型)；SW-CJ-1F型)超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8檢測積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖的抑制作用

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(4～5)×107·L-1，細(xì)胞接種于96孔板中，每孔90 μl，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為400、200、100、50、25 μg·ml-1的積雪草苷，陰性對(duì)照組加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后每孔加入CCK8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=[1-A給藥組-A空白孔)/(A陰性對(duì)照組-A空白孔)]×100%，Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株侵襲能力的影響

Transwell小室4℃預(yù)冷，將趨化因子人纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)涂于小室下層，Matrigel膠包被于小室上層，37℃孵育1 h。根據(jù)1.3.1結(jié)果，選取積雪草苷干預(yù)濃度為200、100、50 μg·ml-1。將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基)，積雪草苷干預(yù)組(細(xì)胞+積雪草苷200、100、50 μg·ml-1)。實(shí)驗(yàn)步驟為先將對(duì)數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株經(jīng)不同濃度積雪草苷處理24 h，陰性對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)不作處理。之后收集細(xì)胞，取5×105細(xì)胞懸浮于小室的上層，小室下方加人含0.1%BSA的培養(yǎng)基600 μl，37℃孵育24 h。經(jīng)多聚甲醛固定，HE染色。每組4復(fù)孔，顯微鏡下選取5個(gè)視野計(jì)算穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力的影響

將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基)，積雪草苷干預(yù)組(細(xì)胞+積雪草苷200、100、50 μg·ml-1)，每組4復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株經(jīng)不同濃度積雪草苷處理24 h后，收集細(xì)胞5×105每孔接種在鋪有Matrigel膠的24孔板中，37℃孵育1 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入20 μlMTS，37℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定黏附在Matrigel膠上細(xì)胞的OD值(波長490 nm)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入終濃度分別為400、200、100、50、25 μg·ml-1的積雪草苷，陰性對(duì)照組加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化細(xì)胞收集于離心管，PBS洗滌一次后將細(xì)胞懸浮于100 μl PBS中，Annexin V-FITC/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖的抑制作用

積雪草苷可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞株的增殖，且隨著濃度增加抑制率增加，其IC50為238.98±2.45 μmol·L-1，濃度-抑制率見表1。

表1 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖的抑制率

注：與空白組相比，*P<0.01。

2.2 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力抑制作用

200、100、50 μg·ml-1積雪草苷干預(yù)后，人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力分別是對(duì)照組的61.2%，47.6%，38.6%(P<0.01)，見圖1。

圖1 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力抑制作用(n=4)

2.3 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株侵襲能力抑制作用

200、100、50 μg·ml-1積雪草苷干預(yù)后，人胃癌SGC-7901細(xì)胞株侵襲能力分別是對(duì)照組的42.3%，31.7%，21.6%(P<0.05)，見圖2。

圖2 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力抑制作用(n=4)

2.4 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

積雪草苷可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株凋亡，400、200、100、50、25 μg·ml-1凋亡率隨濃度增加而增加，凋亡百分率分別為11.89%，13.49%，16.31%，17.2%，25.41%與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3，4。

(a)積雪草苷400 μg·ml-1組 (b)積雪草苷200 μg·ml-1組

(c)積雪草苷100 μg·ml-1組 (d)積雪草苷50 μg·ml-1組

(e)積雪草苷25 μg·ml-1組 (f)陰性對(duì)照組

圖4 積雪草苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株凋亡率影響

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，確診時(shí)多已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，胃癌轉(zhuǎn)移是胃癌最重要的惡性特征，也是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因之一，目前尚缺乏有效治療手段[4]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，穿越基質(zhì)組織和血管壁，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[5]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到嚴(yán)密調(diào)控的程序性細(xì)胞自殺過程，目前認(rèn)凋亡在調(diào)控細(xì)胞增殖、腫瘤的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。由于腫瘤患者免疫能力的異常導(dǎo)致在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡抑制導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步生長，因此細(xì)胞凋亡抑制后比細(xì)胞過度增殖更重要[6]。治療腫瘤的一大目的在于殺死腫瘤細(xì)胞，臨床用的化療、放療和一些生物療法的作用機(jī)制之一就是引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此通過誘導(dǎo)凋亡來治療和預(yù)防腫瘤是一有效措施[7]。

積雪草苷作為積雪草內(nèi)主要的活性成分，已有報(bào)道稱能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖也有一定作用，但是積雪草苷對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移有無影響目前研究較少，因此我們考察了積雪草苷對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移以及凋亡情況，結(jié)果顯示積雪草苷可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞株的增殖，且隨著濃度增加抑制率增加，其IC50為238.98±2.45 μmol·L-1，積雪草苷干預(yù)后人胃癌SGC-7901細(xì)胞株黏附能力和侵襲能力明顯降低，同時(shí)積雪草苷可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株凋亡，提示積雪草苷在防止胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移上有一定作用，但其具體機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步探討。

1 Luo GQ, Li JH, Cao L, et al. Activator protein-1 involvement in proliferation inhibition by gene silencing of Twist in gastric cancer cells[J]. Pathology, 2011，43(7): 697-701.

2 Qiu J, Yu L, Zhang X, et al. Asiaticoside attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via down-regulation of NF-κB signaling pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 26(1): 181-187.

3 Al-Saeedi FJ. Study of the cytotoxicity of asiaticoside on rats and tumour cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14: 220-233.

4 徐文杰,周建獎(jiǎng). 胃癌轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2011, 5(1): 170-173.

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Effects of asiatiocoside on proliferation and apoptosis of SGC-7901 cells*

Kang Min1, Ren Mei-ping2, Zhao Lei3, Deng Ming-ming1, Li Chang-ping1

(1.Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Research Center for Drug and Functional Foods, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;3.Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Harbin 150081)

Objective：To investigate the effects of asiaticoside on proliferation and apoptosis of SGC-7901. Methods: Growth inhibition was measured by cell counting kit-8, the adhesion in vitro was detected by cell adhesion assay; the invasion in vitro was detected by transwell assay; the rate of apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin-V/PI staining. Results: Asiaticoside inhibited the growth of SGC-7901 effectively. The adhesion of cells in vitro was decreased to 61.2% and 38.6% respectively; the invasion in vitro was decreased to 42.3% and 21.6%. Compared with the negative control group, the apoptosis of SGC-7901was significantly induced by different concentration of asiaticoside (P<0.01). Conclusion: Asiaticoside can inhibit the proliferation, induce apoptosis of SGC-7901 and inhibit the metastasis of SGC-7901 in vitro.

Asiaticoside; Gastric carcinoma; Apoptosis; Transfer

四川省衛(wèi)生廳課題(編號(hào)：100282)

2015-4-24)

作者介紹：康敏，女，副教授，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究，Email：354699170@qq.com。

Δ通訊作者：任美萍，女，講師，主要從事藥物分子機(jī)制研究，Email：meishanligang@163.com。