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        培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)

        2015-04-03 16:13:24吐爾遜那依依達(dá)也提
        獸醫(yī)導(dǎo)刊 2015年16期
        關(guān)鍵詞:反應(yīng)速度瓊脂底物

        吐爾遜那依·依達(dá)也提

        (庫爾勒市畜牧獸醫(yī)站,新疆庫爾勒 841000)

        培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)

        吐爾遜那依·依達(dá)也提

        (庫爾勒市畜牧獸醫(yī)站,新疆庫爾勒 841000)

        培養(yǎng)基是人工制備的一種液體或固體營養(yǎng)物質(zhì),是細(xì)菌培養(yǎng)和保存細(xì)胞的基礎(chǔ)。培養(yǎng)基應(yīng)含有相應(yīng)培養(yǎng)細(xì)菌所需的營養(yǎng)成分、pH、應(yīng)無菌。培養(yǎng)基制造的基礎(chǔ)材料為水、肉浸汁(肉湯)、蛋白胨、瓊脂、明膠、酵母浸汁、鹽類和化學(xué)試劑等。然而培養(yǎng)基的質(zhì)量對(duì)生物藥品的制造、分裝及檢驗(yàn)有著至關(guān)重要的作用,因此,在制作培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)特別注意。

        細(xì)菌;酶;培養(yǎng)基;酶促反應(yīng)

        培養(yǎng)基是細(xì)菌的人工養(yǎng)料,根據(jù)細(xì)菌不同要求用人工方法將各種養(yǎng)料配制在一起成為維持和繁殖細(xì)菌的基礎(chǔ),制備適用的培養(yǎng)基,提供細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)條件,了解其生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律,以提高生物制品質(zhì)量和數(shù)量,提高對(duì)病原菌分離培養(yǎng)技術(shù)。故培養(yǎng)基的質(zhì)量對(duì)生物藥品的制造,分裝及檢驗(yàn)有著至關(guān)重要的作用。下面就是我在制作培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中,對(duì)常遇到的一些關(guān)鍵性問題的認(rèn)識(shí)與看法。

        1 把好制作培養(yǎng)基原、輔料質(zhì)量關(guān)

        制作培養(yǎng)基的基礎(chǔ)就是肉肝胃酶消化湯(浸出液),因而牛肉、牛、羊、肝、胃等基礎(chǔ)原料要選擇新鮮、無異嗅、無病變、有彈性、浸出液透明清朗,能提供豐富的營養(yǎng)成分。制備肉浸汁,除選好的材料外,浸漬方法也很重要,浸泡目的是使肉組織的水溶性營養(yǎng)物質(zhì)充分的溶解在水中。經(jīng)做過的冷浸法和熱浸法煮肉湯的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明,冷浸法的效果要比熱浸法好,現(xiàn)多采用冷浸法。由于菌種培養(yǎng)基要求比較高。因此配制時(shí)力求使用新鮮原材料,現(xiàn)配現(xiàn)用,以保證質(zhì)量。不馬上使用的肉湯等要先流通一小時(shí)后送冷庫保存?zhèn)溆?。?duì)于輔助材料,化學(xué)試劑等,都要先經(jīng)廠化驗(yàn)室檢驗(yàn)合格后方可使用。

        2 制備血斜培養(yǎng)基應(yīng)注意的幾點(diǎn)

        2.1 做好消毒準(zhǔn)備工作

        無菌間要徹底熏蒸消毒,采血器皿、分裝物品均要先高壓消毒,以防污染。無菌操作,嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。

        2.2 普通瓊脂在未加血前的制作是很關(guān)鍵的

        首先PH值要適宜,一般控制在8.0左右即可。另外加瓊脂時(shí)也是有要求的。我們做過加粉狀瓊脂和條狀瓊脂的對(duì)比實(shí)驗(yàn),結(jié)果加粉狀瓊脂的培養(yǎng)基加血后不溶血,呈片狀,不能用。而加條狀瓊脂的加血后溶血,效果較好。因而制作鮮血瓊脂培養(yǎng)基時(shí),都采用條狀瓊脂。

        2.3 普通瓊脂加血前要徹底消毒

        待溫度降至48~50℃時(shí),加入采好的羊血,這樣既不至于溫度太高破壞血成分,也不至于溫度太低以至凝固,不能分裝。所以控制好溫度比較重要。

        3 注意控制好培養(yǎng)基的最終PH

        (1)細(xì)菌在培養(yǎng)基中分裂繁殖除溫度、空氣、營養(yǎng)條件外,對(duì)pH的反應(yīng)也很敏感。酸堿度不適宜即便營養(yǎng)最豐富的培養(yǎng)基,細(xì)菌也不能很好地生長(zhǎng)繁殖,或根本不發(fā)育。因而制備培養(yǎng)基必須正確測(cè)定pH。一般測(cè)定法有:a.試紙測(cè)定法,此法簡(jiǎn)單方便,但有誤差。b.比色管測(cè)定法,現(xiàn)普遍采用此法。

        (2)pH測(cè)定最重要的是防止反復(fù)加酸加堿,最好一次加妥。因?yàn)榉磸?fù)加酸加堿會(huì)增加培養(yǎng)基中氯化鈉含量,鹽含量太高會(huì)使?jié)B透壓失去平衡而造成細(xì)菌的死亡,而且反復(fù)加酸加堿易使培養(yǎng)基發(fā)生渾濁和沉淀。為避此現(xiàn)象發(fā)生,采取加堿量計(jì)算的方法防止盲目加堿??尚≡?000毫升加堿量,從而推算全部加堿量。另外還應(yīng)注意以下幾點(diǎn):

        ①標(biāo)準(zhǔn)管必須準(zhǔn)確,定期用電比校對(duì)。

        ②被測(cè)溶液和培養(yǎng)基的溫度不能太高或太低,因?yàn)橹甘緞┰谂囵B(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)與溫度有關(guān)。為真實(shí)反應(yīng)培養(yǎng)基的PH值,測(cè)時(shí)溫度應(yīng)在20~25℃左右近于體溫。

        ③比色管要顏色、厚薄、粗細(xì)必須一致。

        ④加指示劑的吸管和滴管應(yīng)避免與培養(yǎng)基接觸,否則培養(yǎng)基進(jìn)入指示劑內(nèi),造成指示劑反應(yīng)顏色不準(zhǔn),影響結(jié)果。

        ⑤觀察時(shí)應(yīng)在自然光下觀察,避免直對(duì)著太陽光和燈光。

        4 控制好消毒溫度

        培養(yǎng)基的消毒是否徹底是很關(guān)鍵的,消毒溫度和時(shí)間是保證培養(yǎng)基質(zhì)量的重要一環(huán),既要達(dá)到滅菌目的,又要保證各種營養(yǎng)成分不受或少受破壞。一般培養(yǎng)基消毒都是116℃,20~30min,而特殊培養(yǎng)基(如糖類培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基等)就有些特殊之處。溫度太高會(huì)導(dǎo)致糖分解產(chǎn)酸。以前曾多次發(fā)生過沖塞、變色等現(xiàn)象,后經(jīng)幾次實(shí)踐,確定最佳消毒方案即110℃,20min,而且上下磅不能太快,以后很少再出現(xiàn)此類事情。

        5 制作消化湯時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)

        消化湯在培養(yǎng)基制作時(shí)應(yīng)用非常普遍,無論是豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯以及胰酶消化湯,其實(shí)質(zhì)都是酶促反應(yīng)。因此要想消化徹底,必須掌握影響酶促反應(yīng)速度的因素。

        5.1 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

        酶是蛋白質(zhì),消化溫度太高會(huì)使酶變性失活。酶的最適溫度是酶的反應(yīng)速度達(dá)到最高峰的溫度,一般最適宜溫度為40~50℃,60℃以上即開始變性失活。經(jīng)多次實(shí)踐,認(rèn)為豬胃消化湯最適宜溫度為50~53℃,肉肝胃酶消化湯是56~58℃,消化液較清朗、徹底。

        5.2 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響

        酶的活性受所在環(huán)境pH影響,溶液pH不同,酶的活性也不同。在其它條件不變時(shí),酶在一定的pH范圍內(nèi)活性最高,此pH為最適pH,胃蛋白酶最適pH為1.5~2.5,我們一般控制在1.6~2.0,胰蛋白酶最適pH為7.8~8.4。因而無論搞豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯都要加鹽酸,根據(jù)經(jīng)驗(yàn),豬胃消化湯按1%加,肉肝胃酶消化湯按1.2~1.3%量加,測(cè)pH為1.8~2.0為宜。

        5.3 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

        底物濃度與反應(yīng)速度之間存在一定的函數(shù)關(guān)系。肉、肝、胃均為底物,因而要控制好底物與水的比例。一般配制豬胃液的比例是:豬胃:蒸餾水=3:10,如果用于計(jì)數(shù)或選菌最好是3.5~10。肉肝胃酶消化湯比例為:新鮮牛肉2kg,新鮮豬肝0.5kg蒸餾水10000ml。

        5.4 酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

        當(dāng)其他條件相同時(shí),酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比。肉肝胃酶消化湯中加胃蛋白酶0.4~0.5%。豬胃消化酶大多存在于腺體所分泌的消化液中,不需要另加,如胃質(zhì)量差可適當(dāng)加些胃蛋白酶促進(jìn)消化。

        5.5 消化時(shí)間

        規(guī)程規(guī)定胃18~24h,視消化而定。一般我們消化22~24h便停止消化,視湯清朗為宜。抽取上清加熱煮沸,按2.5~3.0%量加入2N氫氧化鈉溶液調(diào)pH達(dá)3.8左右,停止消化,湯備用。

        以上就是培養(yǎng)基在制作時(shí)的幾個(gè)問題,以及影響消化湯消化程度和速度的幾個(gè)因素。

        [1] 孔怡,蔚承祥,鄭錚.如何提高制作母種培養(yǎng)基的質(zhì)量[J].食用菌,2009,(31):27-28.

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