范金明 陳昌如 周亞俊 冒留留

(江蘇省如東縣豐利畜牧獸醫(yī)站,江蘇如東 226008)

轉(zhuǎn)基因雞禽流感抗病育種的研究進展

范金明 陳昌如 周亞俊 冒留留

(江蘇省如東縣豐利畜牧獸醫(yī)站,江蘇如東 226008)

禽流感不僅對家禽生產(chǎn)帶來巨大損失,更重要的還威脅到人類安全,在該病防控研究方面,雖然通過不同亞型不同地區(qū)的流行情況制作了疫苗,但由于其變異性強等特性,防治效果并非完全有效,將轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于抗病育種為從根本上達到抗禽流病毒感染提供了可能,因此,筆者將家禽轉(zhuǎn)基因的制作方法和禽流感抗病育種的研究現(xiàn)狀進行了簡單介紹。

雞;轉(zhuǎn)基因;禽流感;抗病育種

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合癥，自從19世紀(jì)80年代意大利大規(guī)模暴發(fā)禽流感造成重大經(jīng)濟損失以后，人們就開始了對該病的研究[1]，我國在1997年香港大規(guī)模暴發(fā)H5N1禽流感病毒感染人并致人死亡的事件發(fā)生后更加加強了對禽流感的研究和重視[2]，也根據(jù)不同地區(qū)的禽流感流行情況研制出了不同亞型的疫苗，鑒于該病的變異性強、亞型多等原因，禽流感疫苗所取得的對該病的免疫效果一直不理想。面對越來越復(fù)雜的的禽流感流行現(xiàn)狀，如何多途徑的對該病的進行根本性的防控，是目前迫切解決的問題，因此研究抗禽流感病毒轉(zhuǎn)基因雞并進行抗病育種，是一條禽流感防治的有效途徑，也是從根本上攻克禽流感病毒的一項重要技術(shù)。

1 轉(zhuǎn)基因家禽制作方法

1.1 精子載體法

精子在輸卵管內(nèi)與卵子結(jié)合時能準(zhǔn)確找到卵子的雌性原核的特性，直接采用外源DNA或陽離子質(zhì)體包埋外源DNA與成熟精子共孵育后，通過人工授精獲得轉(zhuǎn)基因雞，這種方法簡單、成功率高，具有較高的研究價值。Collares等運用脂質(zhì)體和REMI改進了精子攝取外源DNA量，并成功制備轉(zhuǎn)因雞。Collares等用運用SMGT法制備帶有pEGFP-N1基因的轉(zhuǎn)基因雞，通過PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，新生雛雞的轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)也很可觀。Nakanishi研究發(fā)現(xiàn)雞的精子與脂質(zhì)體DNA復(fù)合體混合培養(yǎng)能夠在大多數(shù)精子頭部檢測到外源DNA，這說明雞精子頭部有一定的吸附外源DNA的能力，并且通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，這些精子具有正常的受精能力和高效率生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚盤的能力。Squries根據(jù)精子膜的這一特性和相似相溶原理將外源DMA與雞精子共孵育，并且檢測出了陽性表達。

1.2 胚盤下腔注射法

剛產(chǎn)出的種蛋中，含有類似ES細胞的干細胞和原始生殖細胞，利用顯微注射的方法將各種載體攜帶的外源基因?qū)肱弑P下腔可以轉(zhuǎn)染，Kwon等通過胚盤注射法將表達EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入129枚雞胚中，孵化21d后獲得13只表達該外源基因的雛雞。Shinji等通過胚盤下腔注射逆轉(zhuǎn)錄莫洛尼鼠白血病病毒導(dǎo)入雞胚中，134個雞胚其中37個成功孵化。Petitte等通過將含隱性白羽性狀雞的胎盤細胞注入到含顯性白羽性狀雞的胚下腔中，獲得11.3%的嵌合體胚胎，通過篩選胎盤中央?yún)^(qū)細胞，已將嵌合比率提高到35%，Etches等和Naito都利用這一方法獲得了轉(zhuǎn)基因嵌合體。

1.3 血液注射法

PGCs細胞在機體的發(fā)育過程中具有特殊的運行路線，雞的PGCs存在于第X期雞胚的胚盤下腔中，隨著血的發(fā)育而進入血液循環(huán)系統(tǒng)中并隨著血液進行循環(huán)，在第14至15期時，血液中的PGCs細胞達到高峰，至24期時，PGCs細胞開始定殖于生殖脊部位，并分化成卵巢中的卵原細胞或精巢內(nèi)的精原細胞。根據(jù)這一特性，Masamichi Kamihira等人將逆轉(zhuǎn)錄病毒注射入卵化55h的雞心臟中，并獲得了可在雞血清和雞蛋中高效表達的scFv-FC，Yoshinori Kawabe等也用相同的方法獲得了轉(zhuǎn)基因的鵪鶉。PGCs轉(zhuǎn)基因法主要針對生殖細胞的轉(zhuǎn)基因，不考慮體細胞的嵌合問題，供體細胞在形成種系細胞后能夠進一步發(fā)育成攜帶外源基因的功能配子，對轉(zhuǎn)基因檢測和后代篩選有重要意義，但可獲得的PGCs細胞數(shù)量少，培養(yǎng)條件還不成熟，PGCs轉(zhuǎn)基因操作比較困難，在該技術(shù)的應(yīng)用過程中有一定的限制性。

1.4 反轉(zhuǎn)錄病毒法

反轉(zhuǎn)錄病毒是依賴RNA進行復(fù)制的RNA病毒，感染宿主細胞后病毒基因反轉(zhuǎn)錄成DNA，即前病毒DNA，DNA前病毒可以整合到染色體上，從而將所攜帶的外源基因插入到宿主染色體上。反轉(zhuǎn)錄病毒的整合只能發(fā)生在M期，發(fā)生在胚胎發(fā)育的晚期，只有部分細胞或組織獲得外源基因。Garba等將Mx1基因轉(zhuǎn)至雞細胞中，使雞獲得了對禽流感的抗性。Kamaura等用與MDV mRNA互補的一段寡核苷酸轉(zhuǎn)至雞體內(nèi)，也使雞獲得了抗性。

2 Mx基因多態(tài)性與抗流感病毒相關(guān)性研究

Mx基因外顯子上存在多個突變位點，通過研究發(fā)現(xiàn)，631與2032位點基因突變與雞流感抗病性可能存在一定的相關(guān)性，具有一定的研究和參考價值。

2002年Ko等[3]通過分析25個不同品種雞的Mx蛋白發(fā)現(xiàn)雞的Mx基因呈多態(tài)性分布，通過與白來航雞核苷酸序列比較，25個有差異的們點中有11個堿基發(fā)生了同義突變，而另外14個發(fā)生了錯義突變，通過載體轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的7個不同品系的Mx蛋白中只有一部分能抵抗流感病毒和VSV感染。進一步比較氨基酸多態(tài)性與Mx蛋白抗病毒活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)雞Mx蛋白第631位點為天冬酰胺（Asn）時，該蛋白具有抗流感病毒活性，而表達為絲氨酸（Ser）時不能阻止病毒增殖。并且將篩選出來的基因插入正常正細胞中，增強其抵抗H5N1型和其他類型禽流感病毒的能力，研究還發(fā)現(xiàn)，很多品種的雞體內(nèi)該基因都存在缺陷。

2008年Benfield等[4，5]公布雞Mx基因由14個外顯子組成，引起631位點多態(tài)性的位點位于最后一個外顯子上，并且該突變位點多態(tài)性表達為Asn時并不能保護雞抵抗H1N1型病毒感染。

Li等[5]檢測紅色原雞、15個中國地方品種雞和4種商品雞第2032位等位基因A和G的頻率，結(jié)果顯示易感基因G的頻率為0.0446～0.9435，抗生基因A的頻率為0.9554。其中地方品種雞等位基因A的頻率為0.7241～0.9554，顯著高于商品雞（0.0565～0.2742）。

Wu等[6，7]對15個不同品種雞的Mx基因2032位進行單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，檢測樣品中存在3種基因型（AA、AG、GG），攜帶易感等位基因G和抗性等位基因A的頻率分別為0.650和0.350，其中紅色原雞中等位基因A所占頻率為0.984，顯著高于地方品種（0.321），提示Mx基因2032位呈現(xiàn)多態(tài)性，且原始品種雞的抗病能力較強。

2010年Xiangqun Ye等[8，9]用Real Time等用Real Time PCR的方法對Mx基因2032位堿基因進行了基因分型，對于采自白來航雞的97個血液樣本通過其溶解曲線進行SNP檢測，此方法對于傳統(tǒng)PCR具有快速、靈敏、易操作等優(yōu)點。

3 展望

抗病育種在控制疾病方面提供了新的途徑，已在許多領(lǐng)域得到了取得了一定的成就，在家畜家禽抗性基因研究中已經(jīng)篩選了大量的基因，并且與相關(guān)抗病性狀進行關(guān)聯(lián)，為人類在抗病育種研究方面提供了許多有價值的參考材料。在禽流感抗病育種研究方面，人們也篩選 出了許多可能存在的與禽流感易感性相關(guān)的基因，特別是對Mx基因位點的多態(tài)性與抗病性狀的相關(guān)性向我們提示了其作為抗病基因的可能，國內(nèi)外抗病育種專家也進行了越來越深的研究，為抗禽流感轉(zhuǎn)基因雞的制作提供了很好的參考依據(jù)，為攻克禽流感的流行難題奠定了一定基礎(chǔ)，相信在不久的將來，隨著基因?qū)爰夹g(shù)、外源基因選擇表達技術(shù)的深入研究和提高，轉(zhuǎn)基因雞抗禽流感的研究一定能夠以實質(zhì)性的變化展現(xiàn)在人們面前。

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