林勁冠

作者單位:410008 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院;410013 湖南省腫瘤醫(yī)院

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大黃酸對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞HER-2蛋白表達(dá)的影響研究

林勁冠

作者單位:410008 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院;410013 湖南省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的探討大黃酸對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞HER-2蛋白表達(dá)的影響。方法應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法，檢測(cè)EGFR、HER-2蛋白的表達(dá)水平變化；MTT檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)癌細(xì)胞的增殖，檢測(cè)其磷酸化、受體PT心通路蛋白的表達(dá)水平的變化；在基因轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HER-2變化。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果賴氨大黃酸(1 mL)可以抑制來(lái)源各不相同的乳腺癌細(xì)胞系(MDA.MB-231和MCF-7、SK-B-3)、HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞系增殖，IC50的實(shí)驗(yàn)使用劑量分別為95 μmol/L 200 mL與85 μmol/L 80 mL和 110 μmol/L 300 mL。在抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖方面RHL接近于大黃酸。對(duì)RHL抗腫瘤機(jī)制中：SK-Bf-3細(xì)胞HER-2、EGFR呈高表達(dá)，其產(chǎn)生細(xì)胞凋亡機(jī)制在于能夠抑制HER-2蛋白、EGFR表達(dá)及蛋白磷酸化水平，造成癌細(xì)胞的p21、p53途徑激活。MCF-7細(xì)胞HER-2低表達(dá)、EGFR高表達(dá)，細(xì)胞的增殖被抑制原因在于EGFR、下游的Raf/MEK/ERK信號(hào)通路磷酸化，其產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)是由于MCF-7細(xì)胞聯(lián)合紫杉醇等化療藥物的使用誘導(dǎo)的。結(jié)論RHL是1種新型抑制劑，能夠抑制HER-2、EGFR雙靶點(diǎn)上的受體蛋白(酪氨酸激酶)、細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗癌作用。

【關(guān)鍵詞】大黃酸；乳腺癌；HER-2蛋白；腫瘤細(xì)胞；影響

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:639～640)

惡性腫瘤是人類健康的第二大殺手，近年來(lái)死于惡性腫瘤的人數(shù)越來(lái)越多，至2000年，腫瘤新發(fā)病例超過(guò)1000萬(wàn)，全部患者超過(guò)2200萬(wàn)。目前，在某些地區(qū)，惡性腫瘤已經(jīng)上升為人類健康頭號(hào)殺手。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物將是人類戰(zhàn)勝惡性腫瘤的重要手段之一。臨床上，靶向藥物的研究使得人類在靶向治療上取得了突破性進(jìn)展，加深了對(duì)腫瘤在形成過(guò)程中的相關(guān)基因、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究[1]。

靶向藥物研究包括基因治療、抗腫瘤血管生成藥物、抗腫瘤疫苗、靶向蛋白酪氨酸激酶的阻斷劑、特定細(xì)胞標(biāo)志物的單克隆抗體，對(duì)部分癌基因及癌細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志藥物等[2]。對(duì)家族的單克隆抗體表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和蛋白酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

1材料與方法

1.1試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基高糖RPMI 1640、DMEM/F12、DMEM購(gòu)自Gibc0公司；MTT、I型膠原酶和明膠、DMSO (二甲基亞砜)購(gòu)自Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、胎牛血清(Gibc0)、特級(jí)胎牛血清(Hyclone) 購(gòu)自TBD公司(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物工程研究所)；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Gibco公司。

1.2癌細(xì)胞株

人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；HUVEC來(lái)自新生兒臍帶內(nèi)皮。人MCF-7細(xì)胞株、乳腺癌SK-Br-3、MDA-MB-23l為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品

賴氨酸購(gòu)于北京科海軍舟生物科技發(fā)展中心；大黃酸，純度98%，購(gòu)于南京市青澤醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司；賴氨大黃酸(1 mL)由本室合成，臍帶提供于友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)于37 ℃水浴中迅速化凍從液氮中取出的凍存細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管后，以3 ml培養(yǎng)基加入，懸浮細(xì)胞。在室溫下，1 000 r/min離心無(wú)菌離心管10 min后棄除上清液。再加入5 ml含胎牛血清培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)至25 cm2方瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。第二天，觀察并記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，適時(shí)更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，以繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。此后以培養(yǎng)基的常規(guī)更換方法，更換并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。SK-Br-3細(xì)胞DMEM高糖培養(yǎng)基中含胎牛血清15%，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、EGFR與HER-2表達(dá)高，傳代一次需3天、一次傳瓶2倍。MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)快、 HER-2表達(dá)低、EGFR表達(dá)高，傳代一次需2天、一次傳瓶4～6倍。MCF-7細(xì)胞的Ⅰ沖M11640培養(yǎng)基中含胎牛血清10%；MDA-MB-231細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基含10%胎牛血清中培養(yǎng)；SK-OV-3卵巢癌細(xì)胞DMEM/F12培養(yǎng)基培基10%胎牛血清，細(xì)胞生長(zhǎng)快、EGFR、HER-2表達(dá)低，傳代一次需2天、一次傳瓶4～6倍[3]。

1.4.2HUVEC細(xì)胞的采集、培養(yǎng)在37 ℃溫箱環(huán)境內(nèi)，孵育用2～3 ml明膠PBs溶液包被的培養(yǎng)瓶，過(guò)夜之后，棄明膠溶液，再以普通的培養(yǎng)液將其沖洗一次[4]。在無(wú)菌平皿中置入臍帶，以注射器，抽取PBS反復(fù)沖洗臍靜脈，直至臍帶沖洗液清亮。更換注射器，于臍帶一端緩緩注入0.1%Ⅰ型膠原酶，待消化液流出于另一端后，止血鉗夾住流出端直至臍帶注滿消化液，止血鉗夾住臍帶2端。將臍帶放置室溫下消化25～30 min后，取0.1%Ⅰ型膠原酶臍帶消化液，放入離心管內(nèi)；此外取培養(yǎng)基沖洗臍帶血管腔得沖洗液，放入離心管內(nèi)，以1 000 r/min 進(jìn)行離心操作，棄離心液上清。完全培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶接種懸細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)約90%融合時(shí)，用1∶2比例消化傳代培養(yǎng)，采用2～5代細(xì)胞進(jìn)行本次研究。

2結(jié)果

1 mL可抑制來(lái)源各不相同的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MCF-7、SK-B-3)、HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞系增殖，IC50的實(shí)驗(yàn)使用劑量分別為95 μmol/L 200 ml和85 μmol/L 80 ml和 110 μmol/L 300 ml。表明對(duì)不同的卵巢癌、乳腺癌細(xì)胞系，RHL有同等抑制作用，對(duì)于HUVEC增殖，RHL比腫瘤細(xì)胞的抑制作用弱。實(shí)驗(yàn)對(duì)RHL、以DMSO做為溶劑的大黃酸，在腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用方面進(jìn)行比較。本結(jié)果顯示：RHL與大黃酸對(duì)腫瘤細(xì)胞有增殖抑制作用。

3討論

近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，是女性第一位的惡性腫瘤[5]。臨床上針對(duì)乳腺癌的治療，有許多方案。目前,對(duì)許多腫瘤化療藥，HER-2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞都有一定程度的耐藥性，乳腺癌患者預(yù)后不佳。

雖然人源化單抗Herc印tin的問(wèn)世，為部分乳腺癌的治療提供了新的方向[6]。但目前，相關(guān)抑癌機(jī)理尚不能統(tǒng)一，其中最主要的2種為：①Herc印tin造成抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)；②單抗Herc印tin可以通過(guò)降低HER.2受體的磷酸化水平，下調(diào)HER.2的表達(dá)，從而使HER.2受體減少，進(jìn)而減少了對(duì)下游信號(hào)通路激活達(dá)到抑抑制癌癥作用[7]。

本次研究結(jié)果顯示：ImL可抑制來(lái)源各不相同的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MCF-7、、SK-B-3)、HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞系增殖。RHL在針對(duì)不同的卵巢癌、乳腺癌細(xì)胞系，有同等的癌癥抑制作用。此外，在HUVEC增殖的抑制作用方面，RHL比腫瘤細(xì)胞弱。本次研究實(shí)驗(yàn)中，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用方面，對(duì)RH、以DMSO做為溶劑的大黃酸兩者的比較結(jié)果顯示：RHL與大黃酸有相近的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。

參考文獻(xiàn)

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(編輯：吳小紅)

Effect of Rhein on the Expression of HER-2 Protein in Breast Tumor Cells

LINJingguan.TheAffiliatedCancerHospitalofXiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha,410008

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of rhein on the expression of HER-2 protein in breast cancer cells.MethodsImmunocytochemistry was used to detect change of EGFR and HER-2 protein expression level.MTT was used to detect the cells proliferation,different phosphorylation levels,level of the expression of receptor PT pathway protein.RT-PCR was used to detect change of HER-2 protein expression in the gene transcription level.FACS was used to detect cell cycle and apoptosis.Results1 mL can inhibit breast tumor cells lines of different origins (MDA,MB-231,MCF-7,SK-B-3 ),human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) proliferation,ovarian cancer cell line SK-OV-3,IC50 was 95 μmol/L,200 ml and 85 μmol/L,80 ml and 110 μmol/L,300 ml.And RHL was similar to rhein in inhibiting the proliferation of tumor cells.Study of mechanism of RHL anti-tumor,high expression of EGFR and HER-2 in SK-Bf-3 cells,which can inhibit EGFR and HER 2 protein expression and phosphorylation level,and can induce tumor cells through p53 and p21 pathways of apoptosis.High expression of EGFR and low expression of HER-2 in MCF-7 cells,inhibited the phosphorylation of EGFR and downstream Raf/MEK/ERK pathway,and with other chemotherapy drugs paclitaxel played a synergistic antitumor effect.ConclusionRHL can inhibit EGFR and HER-2 dual target model,cell proliferation and induction of apoptosis.

【Key words】Rhein;Breast cancer;HER-2 protein;Tumor cell;Influence

(收稿日期2014-10-08修回日期 2015-03-25)

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)05-0639-02

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.05.003