□沈 剛SHEN Gang

乙型病毒性肝炎是我國(guó)傳播范圍最廣、危害性最大的一種感染性疾病，以肝臟炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，容易在此基礎(chǔ)上繼發(fā)肝硬化、慢性肝炎和原發(fā)性肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重疾病，危及患者生命安全[1]。乙肝病毒是乙型病毒性肝炎的感染病毒，當(dāng)前對(duì)其檢測(cè)最為有效的方法即為實(shí)時(shí)熒光定量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測(cè)技術(shù)，其將熒光標(biāo)志技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在對(duì)乙肝病毒DNA的檢測(cè)中具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[2]，但是HBV-DNA的檢測(cè)目前還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于相同標(biāo)本，使用不同儀器、不同試劑檢測(cè)所得出的結(jié)果差別較大。本研究對(duì)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)乙肝DNA的影響因素進(jìn)行分析，同時(shí)提出有針對(duì)性的管理建議，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1.臨床資料。選取2011年8月至2014年10月我院收治并已確診的395例乙型肝炎病毒感染患者為研究對(duì)象，其中男性184例，女性211例；患者年齡16～65歲，平均(49.75±9.53)歲。

2.方法。對(duì)395例患者進(jìn)行血標(biāo)本制作，空腹?fàn)顟B(tài)下抽取肘靜脈血，置入黃蓋血清管，離心后取血清進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)乙肝DNA。核酸擴(kuò)增條件：95℃條件下預(yù)變性3min，94℃(30sec) 60℃（15sec）循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出標(biāo)本中的DNA模板量，根據(jù)試劑盒的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)本的陽(yáng)性質(zhì)控。本研究中所用試劑為艾康生物科技有限公司生產(chǎn)的乙肝DNA檢測(cè)試劑盒，所用儀器為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的StepOne實(shí)時(shí)熒光定量分析儀。以臨床診斷結(jié)果為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)乙肝DNA結(jié)果差異，并對(duì)導(dǎo)致兩者間差異的影響因素進(jìn)行分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以頻率及百分率表示，組間比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)а=0.05。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)乙肝DNA確診374例，占94.7%，漏診誤診21例，占5.3%，兩者對(duì)比差異未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)，說(shuō)明該方法的診斷準(zhǔn)確率較高。

2.影響因素分析。對(duì)影響檢測(cè)結(jié)果的因素進(jìn)行分析，主要包括實(shí)驗(yàn)室條件、標(biāo)本操作（標(biāo)本抗凝血操作、標(biāo)本貯存與溶血和血脂影響）以及核酸提取方法等。見(jiàn)表1。

表1 影響因素分析

討論

1.實(shí)驗(yàn)室條件影響因素。PCR技術(shù)的最大特點(diǎn)是具備極高的靈敏度，但同時(shí)極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生[3]。因此，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)驗(yàn)收和規(guī)范化管理是在臨床上應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)的基本前提。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，包括試劑貯存區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，另外對(duì)人員培訓(xùn)和操作規(guī)程也有具體要求。本研究中，由于實(shí)驗(yàn)室條件影響因素造成漏診誤診3例，占14.3%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室的硬件建設(shè)與軟件規(guī)范均應(yīng)有所加強(qiáng)。

2.標(biāo)本因素影響。包括標(biāo)本抗凝血因素、貯存因素及溶血和血脂因素等。

2.1 標(biāo)本抗凝血因素。由于機(jī)體在感染乙肝病毒后會(huì)血液中會(huì)出現(xiàn)乙肝病毒DNA，因此HBV-DNA的檢測(cè)一般都以血清或血漿作為標(biāo)本。正常情況下EDTA抗凝(紫管)血漿、枸櫞酸鈉(黑管)血漿都可以用于進(jìn)行HBV-DNA PCR檢測(cè)。EDTA與枸櫞酸鈉雖然都能結(jié)合Mg2+，但由于水平充足，不會(huì)影響最終的檢測(cè)結(jié)果[4]。而肝素作為核酸檢測(cè)常用的血液抗凝劑，能抑制聚合酶的活性，被公認(rèn)為PCR反應(yīng)抑制劑，在使用肝素作為抗凝素時(shí)，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本的裂解失效，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)法對(duì)血漿和血清進(jìn)行有效檢測(cè)，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此在PCR檢測(cè)中，盡量避免使用肝素作為抗凝劑。

2.2 標(biāo)本存儲(chǔ)的影響。由于標(biāo)本量及檢測(cè)周期原因，大部分實(shí)驗(yàn)室不會(huì)每天進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)，因此標(biāo)本的貯存相當(dāng)重要。由于細(xì)胞內(nèi)的酶對(duì)DNA具有降解，如靜止時(shí)間超過(guò)3小時(shí)，或貯存溫度超過(guò)25℃時(shí)，會(huì)造成標(biāo)本變性，影響檢測(cè)結(jié)果[5]。所以臨床貯存標(biāo)本HBV-DNA應(yīng)在及時(shí)分離血清或血漿的前提下，將其于-20℃以下環(huán)境貯存。

2.3 溶血及血脂因素。溶血和血脂會(huì)造成血液內(nèi)血紅蛋白變形，導(dǎo)致熒光信息強(qiáng)度發(fā)生變化，影響檢測(cè)結(jié)果。理論上講血紅素可以經(jīng)卟琳環(huán)與Taq酶發(fā)生不可逆的結(jié)合，從而抑制后者活性，因此標(biāo)本發(fā)生溶血時(shí)會(huì)對(duì)HBV-DNA的檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)明顯影響。但也有實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)發(fā)生溶血的HBV-DNA標(biāo)本與未溶血標(biāo)本之間檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其原因或許在于血紅蛋白經(jīng)100℃10分鐘后，已經(jīng)發(fā)生變性，喪失了結(jié)合Taq酶的活性，或者在提取核酸前，經(jīng)過(guò)高速離心沉淀HBV顆粒、棄去上清等處理，大大降低了血紅蛋白帶來(lái)的影響。血脂因素可導(dǎo)致熒光淬滅，降低熒光信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)脂肪或其代謝產(chǎn)物能抑制Taq酶的活性，降低擴(kuò)增效率，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果降低。但亦有實(shí)驗(yàn)證明，高血脂對(duì)檢測(cè)結(jié)果并無(wú)顯著影響。尹琦和徐玉蟬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，三酰甘油小于或等于45.96 mmol/L時(shí)，并不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影。

黃翔等[7]通過(guò)PEG沉淀煮沸法發(fā)現(xiàn)，在膽固醇未高于12mmol/L情況下同，HBV-DNA的檢測(cè)結(jié)果與膽固醇水平間并無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明PEG沉淀煮沸法能有效地去除標(biāo)本中的膽固醇，提高擴(kuò)增效率。

3.核酸提取方法的影響。采用不同的核酸提取方法對(duì)于采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血清HBV-DNA結(jié)果差異較大[8]。李金明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用煮沸裂解法處理血清標(biāo)本的效果較差，而應(yīng)采用核酸純化方法。陳曉東等[10]認(rèn)為，磁珠核酸提取法應(yīng)作為PCR技術(shù)中檢測(cè)中的首選方法，其檢測(cè)結(jié)果與沉淀煮沸裂解法和直接煮沸裂解法均存在顯著性差異(P＜0.05)，其中直接煮沸裂解法的提取效率最低，少于磁珠核酸提取法兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

通過(guò)上述分析，我們認(rèn)為在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：首先要嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)室硬件與軟件建設(shè)，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室檢查條件，嚴(yán)格遵循分區(qū)原則，實(shí)驗(yàn)室人員要嚴(yán)格單向走動(dòng)，避免跨區(qū)操作，同時(shí)在室內(nèi)安裝通風(fēng)設(shè)備，注意對(duì)空氣有可能會(huì)引起檢查誤差的物質(zhì)進(jìn)行及時(shí)排除。其次，嚴(yán)格進(jìn)行試劑盒的選擇；采集標(biāo)本時(shí)要防止污染，避免表皮、體液細(xì)胞及頭發(fā)等成分的混入；處理標(biāo)本采用帶濾芯吸頭，并保證一人一個(gè)吸頭，防止發(fā)生氣溶膠污染；在標(biāo)本貯存時(shí)采用專用冰箱，對(duì)于拆封及未拆封的試劑分開放置，認(rèn)真登記有效期；最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行培訓(xùn)，以提高專業(yè)技能，掌握儀器必要的使用和維護(hù)技術(shù)，定期對(duì)儀器及用具進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在HBV-DNA的檢測(cè)中準(zhǔn)確率較高，具有較高應(yīng)用價(jià)值，但仍有一定的漏診和誤診率，需加強(qiáng)管理，在多方面進(jìn)行綜合預(yù)防。

1 郭楠，李寶萍，李慧萍，等. 反應(yīng)體系對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)乙肝核酸結(jié)果影響的分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013,17(5)：877-879

2 范公忍，韓聚強(qiáng)，胡學(xué)玲，等.兩種核酸提取方法對(duì)血清HBV DNA熒光定量檢測(cè)結(jié)果的影響[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013,23(9)：2110-2112,2114

3 郝維敏，劉杰，楊曉春.標(biāo)本因素對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA的影響[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011,36(3)：295-297

4 高國(guó)生，姜俊，翁彭劍.不同標(biāo)本因素對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2010,22(1)：37-38

5 胡玉弘，陳玲玲，馮軍.標(biāo)本存放時(shí)間對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010,7(24)：7-8

6 尹琦，徐玉蟬.影響HBV DNA測(cè)定的標(biāo)本因素[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2008,26(2)：133-134

7 黃翔，王暉，周志明，等.溶血和脂血標(biāo)本中乙肝病毒DNA提取方法的選擇與評(píng)價(jià)[J].華中醫(yī)學(xué)雜志，2004,28(2)：123-124

8 梅玉峰，黃敏，危艷順.濃縮裂解煮沸法在熒光定量PCR測(cè)定HBV DNA中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009,6(5)：359-360

9 李金明，王露楠，鄧巍.標(biāo)本處理對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定乙肝病毒核酸的影響[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2000,23(6)：337-339

10 陳曉東，陶志華，周武.核酸提取方法在聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定乙肝病毒核酸中的評(píng)價(jià)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002,25(4)：212-214