劉紅利，陳　檬，王宏濤，，吳以嶺，，△［南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京00;河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，河北省絡(luò)病重點實驗室，河北石家莊05005］

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重組可溶性人CD40L誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷*

劉紅利1，陳檬2，王宏濤2，3，吳以嶺1，2，4△
［1南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023;2河北以嶺醫(yī)藥研究院，3國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，4河北省絡(luò)病重點實驗室，河北石家莊050035］

［摘要］目的:探討重組可溶性人CD40L(rshCD40L)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的損傷作用及其在動脈粥樣硬化中的作用。方法:應(yīng)用rshCD40L刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12 h; MTS法觀察HUVECs的生存活性，ELISA法測內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素(E-selectin)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM) -1、組織因子(TF)、組織因子途徑抑制物(TFPI)表達(dá)的變化，比色法測脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果:與正常組比較，不同濃度的rshCD40L(0.5、1、2、3 mg/L)對內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性無明顯影響; 0.5 mg/L rshCD40L即可增加內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin、sICAM-1、TF、TFPI的分泌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，同時增加內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量、降低SOD活性(P＜0.05)。結(jié)論: 0.5～3 mg/L rshCD40L對內(nèi)皮細(xì)胞生存活性無明顯影響，但已經(jīng)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，增加內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和外源性凝血反應(yīng)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物損，使其抗氧化能力下降。

［關(guān)鍵詞］重組可溶性人CD40L;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;動脈粥樣硬化

［修回日期］2015-03-03

Injury effect of recombinant soluble human CD40 ligand on human umbilical vein endothelial cells

LIU Hong-li1，CHEN Meng2，WANG Hong-tao2，3，WU Yi-ling1，2，4
［1Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China;2Hebei Yiling Medical Research Institute，3Key Research Centre of State Administration of Traditional Chinese Medicine (Collateral Disease of Cardiovasculature)，4Key Laboratory of Collateral Disease of Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China.E-mail: weitcm@163.com］

［ABSTRACT］AIM: To investigate the damage in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by recombinant soluble human CD40 ligand (rshCD40L).METHODS: The cultured HUVECs were treated with rshCD40L for 12 h.The survival activity of the HUVECs was observed by MTS assay.The expression of E-selectin，intercellular adhesion molecule (ICAM) -1，tissue factor (TF) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) was measured by ELISA.The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) were detected by the methods of thibabituric acid (TBA).RESULTS: Compared with normal group，different concentrations of rshCD40L (0.5，1，2，3 mg/L) had no obvious effect on the survival activity of the HUVECs (P＞0.05).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L promoted the secretion of E-selectin，sICAM-1，TF and TFPI in the HUVECs (P＜0.01).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L also increased MDA content and reduced the activity of SOD in the HUVECs (P＜0.05).CONCLUSION: 0.5～3mg/L rshCD40L has no obvious effect on endothelial cell survival，but already causes endothelial dysfunction by increasing endothelial inflammation and exogenous coagulation reaction，inducing lipid peroxides injury and reducing antioxidant capacity.

［KEY WORDS］Recombinant soluble human CD40 ligand; Human umbilical vein endothelial cells; Atherosclerosis

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及到炎癥因子、脂質(zhì)代謝、凝血因素、免疫缺陷和遺傳等多種因素相互作用，其中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié)并貫穿于全過程［1］。CD40/CD40L屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和腫瘤壞死因子受體超家族，在免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)中起重要的橋梁作用。國外研究學(xué)者認(rèn)為CD40L的持續(xù)上調(diào)及其促血栓形成和促炎作用是臨床卒中患者慢性期轉(zhuǎn)歸差的因素之一［2］。在我國，也有研究發(fā)現(xiàn)血液中CD40L的單核苷酸多肽性與急性冠脈綜合征的病變程度相關(guān)，是其獨立的危險因素之一［3］。本研究采用重組可溶性人CD40L(recombinant soluble human CD40 ligand，rshCD40L)刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通過觀察rshCD40L刺激HUVECs后內(nèi)皮細(xì)胞生存活性、炎癥因子、凝血相關(guān)因子和氧化損傷的變化來評價rshCD40L對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，進(jìn)一步探討CD40L在AS發(fā)病機制中的作用。

材料和方法

1細(xì)胞、試劑和儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中(內(nèi)含青霉素1×108U/L，硫酸鏈霉素1×108U/L，慶大霉素5×107U/L)，37℃、5% CO2孵箱傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時進(jìn)行分組干預(yù)。

rshCD40L(Miltenyi Biotec)以去離子水配成250 mg/L儲備溶液，除菌過濾，－20℃保存?zhèn)溆?，使用前以?.1% BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋到適當(dāng)濃度。DMEM高糖培養(yǎng)基、MTS試劑(Promega) ; E-選擇素(E-selectin)試劑盒(Ray Bio) ;可溶性細(xì)胞間黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule，sICAM-1)試劑盒(R＆D) ;組織因子(tissue factor，TF)、組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)試劑盒(Assaypro) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

Forma 371細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific) ;多功能酶標(biāo)儀(BioTek) ; KA-1000A飛鴿牌離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2方法

2.1 MTS法檢測rshCD40L誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在上述條件下培養(yǎng)24 h后，更換不含血清的培養(yǎng)基，模型組加入rshCD40L使其終濃度分別為0.5、1、2、3 mg/L，正常組不加rshCD40L干預(yù)，每組設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)12 h。棄去舊培養(yǎng)液，每孔加100 μL MTS孵育1 h，在多功能酶標(biāo)儀上于570 nm處測定吸光值(A值)。

2.2rshCD40L誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在上述條件下培養(yǎng)24 h后，更換不含血清的培養(yǎng)基，模型組加入rsh-CD40L使其終濃度為0.5 mg/L，正常組不加rsh-CD40L干預(yù)，每組4個復(fù)孔繼續(xù)貼壁培養(yǎng)12 h。收集每孔細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3比色法測rshCD40L誘導(dǎo)HUVECs MDA和SOD的含量對數(shù)生長的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1× 105接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，在上述條件下培養(yǎng)24 h后，更換不含血清的培養(yǎng)基，模型組加入rshCD40L使其終濃度為0.5 mg/L，正常組不加rshCD40L干預(yù)，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)12 h。棄去培養(yǎng)基，5%胰酶消化收集細(xì)胞，生理鹽水清洗2遍，超聲破碎，收集細(xì)胞裂解液，取2 μL進(jìn)行蛋白定量，剩余細(xì)胞裂解液按試劑盒說明書操作檢測。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS 17.0行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 rshCD40L對HUVECs生存活性的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L輕微降低內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著rshCD40L濃度的增加，各組對內(nèi)皮細(xì)胞生存活性的影響與正常組比較及各組間比較均無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。后續(xù)實驗采用0.5 mg/L濃度刺激內(nèi)皮細(xì)胞。

Figure 1.The effect of rshCD40L at different concentrations on the cell viability of HUVECs.Mean±SD.n=4.圖1 rshCD40L不同濃度組的細(xì)胞存活率

2 rshCD40L對HUVECs表達(dá)E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L孵育內(nèi)皮細(xì)胞12 h可刺激內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中黏附分子E-selectin、sICAM-1表達(dá)增加，促進(jìn)組織因子TF表達(dá)，同時降低TFPI水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1　 rshCD40L對內(nèi)皮細(xì)胞不同細(xì)胞因子表達(dá)的影響Table 1.The effects of rshCD40L on the expression of different cytokines in HUVECs (Mean±SD.n=4)

3 rshCD40L對HUVECs MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L孵育內(nèi)皮細(xì)胞12 h可顯著升高細(xì)胞裂解液中MDA的含量，降低SOD活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2　 rshCD40L對內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量和SOD活性水平變化的影響Table 2.The effects of rshCD40L on the changes of MDA and SOD in the HUVECs (Mean±SD.n=4)

討論

CD40與CD40L屬于TNF受體/TNF超家族成員，為跨膜糖蛋白，表達(dá)于多種與AS相關(guān)的細(xì)胞表面［4］，如內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和T細(xì)胞等，兩者以配體-受體結(jié)合的形式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)，在AS早期內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、粥樣斑塊不穩(wěn)定性和血栓形成過程中均是重要的參與者［5-6］。其中CD40L主要表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞和血小板上，血小板活化后，可在數(shù)分鐘內(nèi)將內(nèi)部儲存的CD40L迅速轉(zhuǎn)移至膜表面并在蛋白水解酶的作用下從膜表面脫落形成可溶性的CD40L，有研究資料顯示，血液中95%的sCD40L是由血小板活化后釋放的［7］，sCD40L具有CD40L相同的生物學(xué)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)膜的屏障，直接受到各種危險因素的刺激而發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)改變，其功能障礙則是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。正常內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)CD40受體，體內(nèi)存在或體外給予外源性的可溶性CD40L均能與內(nèi)皮細(xì)胞CD40結(jié)合相互作用誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活黏附分子、炎癥因子、趨化因子等的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成AS早期炎癥反應(yīng)并加速斑塊形成［8-9］。有研究表明，CD40L還可通過激活PI3K信號通路增加活性氧的表達(dá)［10］;上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶家族，降解斑塊成分，使斑塊易于破裂增加斑塊的不穩(wěn)定性［11］; CD40/CD40L還可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的促凝活性，促發(fā)血栓形成［12］。本研究結(jié)果顯示0.5 mg/L的rshCD40L即可顯著增強內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-selectin和sICAM-1，與之前的研究結(jié)果相符。E-selectin和sICAM-1表達(dá)增多加強了炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化黏附的作用，擴大局部的炎癥反應(yīng)。TF與TFPI是體內(nèi)維持凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)平衡的相互制約的一對因子，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凝血活性增強是AS血栓形成的主要病理基礎(chǔ)［13］。本研究同樣觀察到0.5 mg/L的rshCD40L不僅增加內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)，促使纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化，發(fā)揮促凝效應(yīng)，同時還能夠降低凝血因子途徑抑制物(TFPI)的表達(dá)，使抗凝功能紊亂。既往研究證實，AS患者和動物模型中均有氧自由基損傷，機體的脂質(zhì)過氧化物和抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致體內(nèi)大量氧自由基蓄積，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)劇烈，最終引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，細(xì)胞凋亡、壞死。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的高低常被用來評價機體受氧化損傷程度輕重的重要檢測指標(biāo)，而SOD則可以清除體內(nèi)過多的氧自由基，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。對于CD40L是否可以引起內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷鮮有報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rshCD40L刺激作用下的內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量顯著升高，而SOD活性則明顯下降，提示CD40L可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基損傷，降低內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能，可能為CD40/CD40L促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的另一機制。另外，既往研究多提示CD40L對多種腫瘤細(xì)胞具有促凋亡和抑增殖作用，本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的rshCD40L對內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性則無明顯影響，分析原因可能為腫瘤的免疫抑制特點，CD40/CD40L能夠為B細(xì)胞、T細(xì)胞提供活化的第一、第二信號，增加樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈能力，控制癌細(xì)胞生長;另外，細(xì)胞間的相互作用不僅僅通過CD40/CD40L通路發(fā)揮損傷效應(yīng)，同時存在其它機制協(xié)同擴大損傷反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而本研究中采用單因素的細(xì)胞因子造模，損傷程度相對減輕。盡管rshCD40L不能引起內(nèi)皮細(xì)胞生存活性改變，但內(nèi)皮細(xì)胞分泌的黏附分子(E-selectin、sICAM-1)、組織因子(TF)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)等損傷因子增多，而保護(hù)因子如TFPI、SOD則明顯減少，提示我們內(nèi)皮細(xì)胞此時已經(jīng)發(fā)生了早期功能障礙，處于應(yīng)激-自我修復(fù)狀態(tài)。總之，rshCD40L能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥、凝血反應(yīng)，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)來損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞早期功能障礙。

減輕內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞生理功能并早期發(fā)現(xiàn)能代表內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的生物標(biāo)志物對于動脈粥樣硬化的防治起重要作用。一些藥物如他汀類、氯吡格雷和傳統(tǒng)中醫(yī)中藥等發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用也與其能夠調(diào)節(jié)CD40/CD40L有關(guān)［14-16］。因此，針對CD40/CD40L進(jìn)行早期干預(yù)、防治對內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷也成為動脈粥樣硬化治療的一個策略。［參考文獻(xiàn)］

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通訊作者△Tel: 0311-85901553; E-mail: weitcm@163.com

*［基金項目］國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No.2012CB518606)

［收稿日期］2014-10-15

［文章編號］1000-4718(2015)06-1111-04

［中圖分類號］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.025