饒燕飛 ，劉靜 ，章海斌 ，姚心韻 ，丁偉榮

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006；2、四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院2010級，四川 成都 610041；3、江西省人民醫(yī)院血液科，江西 南昌330006)

骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndromes，MDS)是一組異質(zhì)性克隆性造血干細胞疾病，表現(xiàn)為難治性的一系或多系血細胞減少，因其具有高風險向急性白血病轉(zhuǎn)化的特征而嚴重危害人們的生命健康。臨床上，MDS的診斷分型與預(yù)后判斷主要基于病理學(xué)和細胞遺傳學(xué)特征，如骨髓原始細胞數(shù)、染色體組型和外周血細胞減少程度等。最近研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者外周血循環(huán)microRNAs對疾病的診斷和預(yù)后亦有良好鑒別效果，尤其是在預(yù)后判斷方面，let-7a和miRNA-16的準確性已超過常用預(yù)后評分系統(tǒng)[1]。

近年研究證實，miRNA-144在造血系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，參與紅系細胞的分化調(diào)節(jié)[2]，促進慢性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展[3]，影響急性髓系白血病預(yù)后[4]。但其與造血系統(tǒng)異常的MDS的相關(guān)性尚無相關(guān)研究提及，本研究將就miRNA-144在MDS中的表達情況及其臨床意義做一初步探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2011年3月至2013年12月間確診的MDS患者，分型標準參照世界衛(wèi)生組織(TheWorld Health Organization,WHO)2008年分型診斷標準。共納入MDS病例24例，同時收集12例健康志愿者作為對照組。所有研究對象均收集EDTA抗凝全血3ml，離心取血漿備用。納入標準：(1)首次就診，未經(jīng)任何治療；(2)分別經(jīng)形態(tài)學(xué)及病理學(xué)確診；(3)未合并其它血液系統(tǒng)疾病。排除標準：(1)診斷或分型不明確者；(2)合并其它嚴重消耗性疾病者。

1.2 microRNA檢測 取500μl血漿，使用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，溶解于DEPC處理過的蒸餾水中，檢測OD260/OD280及濃度，取合格樣本應(yīng)用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行qRT-PCR。miRNA-144及U6內(nèi)參引物序列如下：miRNA-144 正 向 ：5’-GCT GGG ATA TCA TCA TAT ACT G-3’， 反向：5’-CGG ACT AGT ACA TCA TCT ATA CTG-3’；U6 正 向 ：5’-CTC GCT TCG GCA GCA-3’；反向：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。 QRT-PCR反應(yīng) 在 ABI7500 PCR儀上進行，反應(yīng)體系為20μl，含cDNA 1μl，Takara SYBR Green IMastermix(2×)12.5μl， 引物各0.5μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，dH2O 5.1μl。反應(yīng)條件為：95℃變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和熔解曲線，以U6表達量為內(nèi)參照標準，根據(jù)雙Delta法[5]計算miRNA-144的相對表達量，計算公式為：

(1)基因相對表達量=2-ΔΔCt；

(2)ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)MDS-(CtmiRNA-CtU6)control。

1.3 統(tǒng)計分析 qRT-PCR每次測定均設(shè)置3個復(fù)孔，結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示，以 REST 2009軟件輔助分析。兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS v19.0完成。

2 結(jié)果

2.1 病例特征 對照組為12例健康體檢者，其中男、女各6例，年齡20~70歲，中位年齡52歲。納入的24例MDS患者男13例，女11例，年齡31~79歲，中位年齡64.5歲，其余臨床特征見表1。

表1 24例MDS病例資料

2.2 miRNA-144在MDS中的表達 根據(jù)雙Delta法計算miRNA-144的相對表達量 (即MDS中miRNA-144表達量相對于對照組miRNA-144表達量的倍數(shù))，健康對照組表達量為1，MDS組相對表達量為 5.07±2.38，MDS各亞組表達量見圖 1，RCUD、RCMD、RARS、RAEB-1 及 RAEB-2 各 組miRNA-144的相對表達量分別為3.81±1.46、3.64±1.30、4.56±0.18、6.49±2.01 及 8.73±2.80， 均顯著高于健康對照組，P＜0.01。

圖1 MDS中m iRNA-144的相對表達量

2.3 miRNA-144與MDS預(yù)后 依據(jù)MDS的WHO分型預(yù)后積分系統(tǒng)(WPSS)，本研究將MDS類型歸為預(yù)后好類，包括RCUD、RCMD和RARS型，和預(yù)后差類，包括RAEB-1和RAEB-2型。miRNA-144在預(yù)后好和預(yù)后差組中的相對表達量分別為3.81±1.23和7.18±2.38，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，結(jié)果見圖 2。

圖2 m iRNA-144相對表達量與MDS預(yù)后相關(guān)

3 討論

miRNA是廣泛存在于動植物中的一類內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，其通過整合入基因沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex，RISC)特異性識別和結(jié)合目的mRNA的3′端非編碼區(qū)或者直接降解mRNA而抑制靶mRNA的翻譯，調(diào)控基因的表達，miRNA認為是基因表達轉(zhuǎn)錄后微調(diào)節(jié)的重要機制，其在細胞增殖、分化和死亡中起重要作用，并參與生物學(xué)進程的所有方面[6]。

MDS的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及遺傳不穩(wěn)定性、造血干祖細胞功能異常、免疫監(jiān)視功能受損和骨髓微環(huán)境異常等。目前，眾多研究已經(jīng)證明microRNAs與血細胞的增殖分化[7]及MDS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在不同類型和危險度的MDS患者體內(nèi)呈特征性表達[8,9]。我們的研究顯示，miRNA-144在MDS中的表達量顯著高于正常對照組，且分類統(tǒng)計顯示，所有類型MDS的miRNA-144的升高均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明miRNA-144升高在MDS中具有一定的普遍性，這提示我們，miRNA-144與MDS具有一定相關(guān)性。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，miRNA-144能調(diào)節(jié)早期紅細胞的成熟和增生，敲除miRNA-144能顯著降低紅系細胞的分化成熟能力，并且miRNA-144在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)基因表達對于穩(wěn)定紅細胞生成至關(guān)重要[2，10]，由此我們推測，MDS中miRNA-144的高表達狀態(tài)很可能是紅系代償性增生的結(jié)果，當然，鑒于miRNAs靶基因的多樣性及其功能的復(fù)雜性，miRNA-144在MDS中的高表達可能還有其它原因，這有待于進一步研究證實。

另一方面，我們的研究顯示，在MDS亞型RAEB-1和RAEB-2中，miRNA-144的升高程度顯著高于 RCUD、RCMD和 RARS亞型。根據(jù)WPSS預(yù)后評分系統(tǒng)，RAEB-1和RAEB-2屬于高危因素，而RCUD、RCMD和RARS相對屬于低危因素，這提示我們，miRNA-144的表達量可能有助于MDS的預(yù)后判斷。目前，miRNAs作為新興的疾病診斷、預(yù)后分子標志物已得到大量研究證實[11-15]，其中l(wèi)et-7a和miRNA-16已被證實當其用于MDS預(yù)后評估時，其準確性已超過常用預(yù)后評分系統(tǒng)[1]。鑒于此，我們將繼續(xù)研究miRNA-144對MDS的預(yù)后判斷能力，以期發(fā)現(xiàn)新的MDS預(yù)后評估分子標志物。

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