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        FLAER檢測及其在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷中的意義

        2015-03-28 02:11:08劉淑媛萬臘根聞芳李欣張長林
        關(guān)鍵詞:單核細(xì)胞貧血外周血

        劉淑媛,萬臘根,聞芳,李欣,張長林

        (南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 南昌330006)

        陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種或幾種造血干細(xì)胞發(fā)生PIG-A基因突變,導(dǎo)致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol,GPI)錨蛋白合成障礙,引發(fā)細(xì)胞膜錨連蛋白缺失,補(bǔ)體活化異常所致的溶血性疾病[1]。目前通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面CD55、CD59的缺失已成為診斷PNH的首選實(shí)驗(yàn)方法;但CD55、CD59等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)還會(huì)受到其它因素的影響,如骨髓增生異常綜合征(MDS)、細(xì)胞發(fā)育不全等均有可能導(dǎo)致膜蛋白的缺失[2],因此仍有一定的局限性。隨后,Brodsky等[3]發(fā)現(xiàn)PNH細(xì)胞對(duì)氣單胞菌溶素抵抗,利用這一特性可區(qū)分GPI+和GPI-細(xì)胞。經(jīng)過改進(jìn),目前已經(jīng)可以用熒光標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體(fluorescent aerolysin,FLAER),使之成為診斷PNH更特異的方法。我們利用流式細(xì)胞儀對(duì)臨床患者的血標(biāo)本進(jìn)行FLAER及CD55、CD59檢測,對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較,以探討FLAER檢測在PNH診斷中的意義。

        1 材料與方法

        1.1 研究對(duì)象 所有患者均為南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年至2014年的門診或住院患者。其中PNH患者10例,經(jīng)補(bǔ)體相關(guān)溶血試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測確診;非PNH貧血患者37例,均為缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血等營養(yǎng)不良性貧血患者。

        1.2 儀器與試劑 美國Beckman-Coulter公司FC500 型流式細(xì)胞儀 (FCM),CD14-ECD、CD24-PC5、CD55-PE和CD59-FITC熒光標(biāo)記單克隆抗體、FLAER試劑及紅細(xì)胞裂解液均購自美國Beckman公司。

        1.3 方法

        1.3 .1 外周血紅細(xì)胞CD55、CD59檢測 EDTA抗凝外周血標(biāo)本以生理鹽水稀釋,調(diào)整紅細(xì)胞數(shù)為109/L;取30μl紅細(xì)胞懸液于流式專用試管中,分別加入3μlFITC標(biāo)記的鼠抗人CD59和3μlPE標(biāo)記的鼠抗人CD55抗體,混勻后室溫避光標(biāo)記15min;生理鹽水洗去游離抗體,加入600μl生理鹽水懸浮細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗體標(biāo)記率。

        1.3 .2外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞FLAER檢測 取30μl全血分別加入 2μlFLAER 試劑、3μlECD 標(biāo)記的鼠抗人CD14和3μlPC5標(biāo)記的鼠抗人CD24抗體,混勻后室溫避光標(biāo)記15min;加入200μl紅細(xì)胞裂解液,室溫孵育10min,生理鹽水洗滌2次,加入600μl生理鹽水懸浮細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗體標(biāo)記率。

        1.3 .3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PNH患者外周血紅細(xì)胞CD55、CD59抗原缺失表達(dá) 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,非PNH貧血患者的外周血紅細(xì)胞表面抗原CD55、CD59均未見明顯表達(dá)缺陷,結(jié)果顯示CD55、CD59僅存在單一表達(dá)峰 (見圖 1A、1B);CD55-占 (3.31±4.26)%,CD59-占(0.78±1.39)%。 PNH 組中 2 例 CD55-、CD59-<5%,8例患者外周血中同時(shí)存在正常及CD55、CD59缺陷的2群紅細(xì)胞,部分患者在弱陽性區(qū)可見一群細(xì)胞,為CD55/CD59部分缺陷的紅細(xì)胞(見圖1E);紅細(xì)胞膜CD55、CD59抗原表達(dá)缺失率分別為(35.54±21.91)%和(32.32±22.04)%,與非 PNH 貧血組比較明顯升高(P<0.05),見表 1。

        圖1 PNH患者和非PNH貧血患者外周血紅細(xì)胞CD55、CD59檢測

        表1 PNH組和非PNH貧血組外周血細(xì)胞抗原缺失率(x±s,%)

        2.2 PNH患者外周血FLAER檢測分析 通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測,分別采用CD14、CD24對(duì)外周血單核細(xì)胞、粒細(xì)胞進(jìn)行靶向標(biāo)記,結(jié)果顯示,PNH患者外周血粒細(xì)胞FLAER陰性率達(dá) (82.52±25.24)%,單核細(xì)胞FLAER陰性率達(dá) (79.84±19.86)%;與CD55、CD59的陰性率相比,有顯著升高 (P<0.05)。其中6例PNH患者同時(shí)伴有CD24、CD14抗原的缺失(見圖2A、2B)。對(duì)于PNH患者,F(xiàn)LAER分析檢出率達(dá)100%;而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結(jié)果(如圖3所示)。非PNH貧血患者外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均為FLAER陽性(見圖2C、2D)。由此可見,外周血FLAER檢測的敏感性和特異性均比CD55、CD59檢測更好。同時(shí),與傳統(tǒng)的CD55、CD59相比,F(xiàn)LAER分析法區(qū)分的GPI+和GPI-2群細(xì)胞也更直觀,易于分辨(圖2 所示)。

        3 討論

        陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性紅細(xì)胞膜缺陷性疾病,臨床表現(xiàn)主要為清晨醬油色尿,慢性血管內(nèi)溶血,可伴有全血細(xì)胞減少和反復(fù)血栓形成[4]。傳統(tǒng)診斷PNH常用的方法有Ham試驗(yàn)、蔗糖溶血試驗(yàn)、尿Rous試驗(yàn)等;但這些方法敏感性、特異性差,容易受到其它因素的影響,如PNH發(fā)作時(shí)呈典型的血管內(nèi)溶血,Ham試驗(yàn)陽性具有診斷價(jià)值[5],而對(duì)于緩解期臨床癥狀好轉(zhuǎn)的病人,Ham試驗(yàn)等溶血性貧血相關(guān)試驗(yàn)常呈陰性,易造成漏診。

        圖2 PNH患者和非PNH貧血患者外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的FLAER分析

        圖3 對(duì)1例PNH患者外周血細(xì)胞FLAER與CD55、CD59檢測比較

        20世紀(jì)80年代以來,對(duì)PNH的研究逐步深入,該病的發(fā)生機(jī)制被證實(shí)是由于造血干細(xì)胞發(fā)生PIG-A基因突變,導(dǎo)致糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨蛋白合成障礙,造成血細(xì)胞表面錨連蛋白的缺失,紅細(xì)胞因表面缺乏補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白如CD55、CD59而對(duì)補(bǔ)體敏感[1]。而PNH患者的多數(shù)臨床表現(xiàn)均可歸因?yàn)槭芾奂?xì)胞表面此類蛋白的缺乏。因此通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59逐漸成為診斷PNH的金標(biāo)準(zhǔn),并可以對(duì)PNH血細(xì)胞進(jìn)行定量分析[6]。隨著研究的不斷深入,學(xué)者發(fā)現(xiàn)很多干細(xì)胞疾病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)和免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)患者中均可檢出 CD55-/CD59-細(xì)胞[7-9],CD55、CD59檢測對(duì)于PNH的診斷仍有一定的局限性。在這種情況下人們找到了FLAER分析法彌補(bǔ)其不足。1999年,Brodsky等[3]發(fā)現(xiàn)PNH細(xì)胞對(duì)氣單胞菌溶素抵抗,利用這一特性可區(qū)分GPI+和GPI-細(xì)胞。經(jīng)過改進(jìn),用熒光標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體 (fluorescent aerolysin,FLAER),使之特異性地與細(xì)胞膜上的GPI錨連蛋白結(jié)合而直接反映錨連蛋白的缺失情況。因此FLAER診斷的特異性與其它靶向標(biāo)記抗原相比較而言有所提高。

        本研究中,我們采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)10例PNH患者和37例非PNH貧血患者進(jìn)行檢測,結(jié)果表明FLAER對(duì)區(qū)分正常和異常的細(xì)胞群更加明顯,并且非PNH患者FLAER呈100%陽性,而CD55-占(3.31±4.26)%,CD59-占 (0.78±1.39)%。 由此說明FLAER分析法較CD55、CD59檢測假陰性率低,特異性好。通過對(duì)FLAER和CD55、CD59檢測結(jié)果進(jìn)行比較,對(duì)于PNH患者,F(xiàn)LAER分析檢出率達(dá)100%;而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結(jié)果 (如圖3所示)。這2例患者外周血紅細(xì)胞CD55-、CD59-<5%, 而 FLAER 檢測粒細(xì)胞陰性率分別為67.3%、17.4%,單核細(xì)胞陰性率分別為54.3%、52.5%,明顯存在GPI錨連蛋白的缺失。造成這一結(jié)果的原因一方面可能是PNH患者處于發(fā)作期,呈典型的血管內(nèi)溶血的臨床表現(xiàn),紅細(xì)胞溶解而影響紅細(xì)胞表面抗原檢測結(jié)果;另一方面可能是貧血患者采用輸血作為治療手段,導(dǎo)致CD55、CD59缺陷紅細(xì)胞稀釋而影響檢測結(jié)果。同時(shí),由于紅細(xì)胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好地與錨連蛋白結(jié)合,因此我們首先利用CD24和CD14對(duì)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行靶向標(biāo)記,再進(jìn)行FLAER分析。這樣提高了FLAER檢測的敏感度,避免輸血或溶血導(dǎo)致的PNH克隆的減少,對(duì)于PNH的診斷更有意義。此外,我們發(fā)現(xiàn)PNH患者外周血中粒細(xì)胞FLAER陰性率達(dá)(82.52±25.24)%,單核細(xì)胞 FLAER陰性率達(dá)(79.84±19.86)%,PNH 克隆數(shù)明顯大于 CD55、CD59抗原檢測。進(jìn)一步說明與CD55、CD59檢測相比,F(xiàn)LAER技術(shù)對(duì)PNH診斷具有更大的優(yōu)勢。

        目前已證實(shí)PNH的發(fā)生是由于造血干細(xì)胞PIG-A基因突變所致,PNH克隆可累及幾乎所有血細(xì)胞;本研究結(jié)果顯示在10例PNH患者外周血中,紅系PNH克隆數(shù)均明顯低于粒系和單核系,說明紅系的PNH克隆檢測并不能完全反映患者的真實(shí)情況,這可能與紅細(xì)胞壽命較短有關(guān)。因此,F(xiàn)LAER對(duì)白細(xì)胞的分析能夠更可靠地反映PNH克隆情況,這對(duì)PNH微小克隆的檢測、PNH血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其治療具有重要意義。

        綜上所述,F(xiàn)LAER技術(shù)對(duì)PNH的診斷比CD55、CD59檢測更加特異、敏感、直觀;FLAER分析更能反映PNH克隆的變化情況,對(duì)PNH微小克隆的檢測及治療具有重要價(jià)值。

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