陳暉 ，方華 ，張怡評(píng) ，陳偉珠 ，洪專 ，易瑞灶

(1.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005；

2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361005)

海藻糖是一種分子結(jié)構(gòu)明確的天然二糖，由兩個(gè)葡萄糖分子通過半縮醛羥基以α–1，1糖苷鍵結(jié)合，其二水合物分子式為C12H22O11·2H2O，相對(duì)分子質(zhì)量為378.33。海藻糖無毒性，水溶性好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。近年來，國(guó)內(nèi)外的眾多研究表明海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，國(guó)際上用它作為生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，在保護(hù)基因工程酶類、各種病毒、疫苗、抗體、蛋白質(zhì)因子、核酸等方面都取得了很好的結(jié)果，在食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥、分子生物化學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景［1］。

目前國(guó)內(nèi)外高度重視海藻糖在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)利用，已有食用級(jí)海藻糖和藥用輔料級(jí)海藻糖在市場(chǎng)上銷售使用，但是國(guó)內(nèi)未見海藻糖國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報(bào)道及銷售，使得國(guó)內(nèi)對(duì)海藻糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制及藥理藥效學(xué)研究完全依賴于昂貴的進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)樣品［2］，限制了對(duì)海藻糖的深入研究。筆者以食品級(jí)海藻糖粗品為原料，純化制備了海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，解決了海洋天然活性物質(zhì)中結(jié)構(gòu)近似的糖類化合物難以分離的共性技術(shù)問題，對(duì)加速海藻糖活性的理論研究與應(yīng)用基礎(chǔ)研究、促進(jìn)海洋生物醫(yī)藥的發(fā)展具有積極的推動(dòng)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離 子 色 譜 儀：ICS 3000型，美 國(guó)Thermo Scientifi c公司；

紅外光譜儀：VERTEX 70型，美國(guó)Bruker公司；質(zhì)譜儀：3100型，美國(guó)Waters公司；

核磁共振儀：400 MHz，美國(guó)Bruker公司；

單晶衍射儀：SuperNova型，美國(guó)Agilent公司；天平：AL／104型，瑞士Mettler Toledo公司；純水機(jī)：Milli-Q型，美國(guó)Milli-pore公司；

氫氧化鈉溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，美國(guó)Thermo Scientifi c公司。

1.2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

以食品級(jí)海藻糖粗品為原料，經(jīng)熱溶冷析結(jié)晶、乙醇結(jié)晶、減壓干燥等方式獲得純度不低于99%的海藻糖。

1.3 定性分析

采用紅外吸收光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、單晶衍射等對(duì)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

1.4 定值分析

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品含量采用高靈敏度的離子色譜法［3］進(jìn)行測(cè)定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：CarboPac PA–10柱(250 mm×4 mm，美國(guó) Thermo Scientifi c)；流動(dòng)相：30 mol／L NaOH溶液；流量：0.8 mL／min；積分安培檢測(cè)器，標(biāo)準(zhǔn)4電位檢測(cè)；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：30℃。

1.4.2 樣品配制

精密稱取海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品0.150 g，用水溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻后精密移取1 mL至250 mL容量瓶中，定容，搖勻，用0.2 μm微孔濾膜過濾，按照1.4.1色譜條件進(jìn)行純度檢測(cè)，進(jìn)樣25 μL。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定3 次。

1.5 均勻性檢驗(yàn)

對(duì)同一批制備的海藻糖樣品進(jìn)行分裝，每瓶?jī)糁貫? g，共400瓶。按照GB／T 15000.3–2008［4］規(guī)定，確定抽樣數(shù)目為15個(gè)，采用單因素多水平試驗(yàn)方差分析法對(duì)海藻糖樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，測(cè)定方法采用離子色譜法，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。檢測(cè)數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。

1.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

取海藻糖樣品模擬上市包裝，在(40±2)℃，相對(duì)濕度為(75±5)%的條件下進(jìn)行24個(gè)月長(zhǎng)期試驗(yàn)，分別于 0，3，6，9，12，18，24 個(gè)月取樣，采用離子色譜法進(jìn)行檢測(cè)，考察其樣品純度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的定性分析

利用紅外吸收光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜以及單晶衍射對(duì)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

圖1、圖2分別是海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外光譜、質(zhì)譜圖。海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的核磁解析數(shù)據(jù)見表1。

圖1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外光譜圖

圖2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖

表1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的核磁共振數(shù)據(jù)歸屬(D2O介質(zhì))

由圖1可知，海藻糖結(jié)構(gòu)中存在羥基(—OH)、亞甲基(—CH2)、碳與氧的單鍵連接。樣品質(zhì)譜圖中，在負(fù)離子電噴霧狀態(tài)下測(cè)得準(zhǔn)分子離子峰為m／z 341［M–H］+，與其相對(duì)分子質(zhì)量(342)相符。此外，在該質(zhì)譜圖中還可見到m／z 179(C6H11O6)和m／z 163(C6H11O5)的少量碎片，與該化合物為兩個(gè)六碳糖相連而成的結(jié)構(gòu)相符。

由表1可知，該化合物的各質(zhì)子、各碳的化學(xué)位移與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致，且質(zhì)子數(shù)、碳原子數(shù)與海藻糖的分子式一致。其中，端基質(zhì)子δ5.08 (d，J=4.0 Hz)為耦合常數(shù)4.0 Hz的二重峰，屬于D–葡萄糖的1位質(zhì)子與2位質(zhì)子呈e-a立體關(guān)系，表明為α立體構(gòu)型。由于該分子呈完全對(duì)稱的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，表明兩個(gè)葡萄糖之間以α，α鍵相連而成［5］。

通過培養(yǎng)獲得海藻糖單晶，選擇大小適度、晶質(zhì)良好的單晶體，利用X–衍射技術(shù)進(jìn)行晶體的測(cè)定和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明該化合物為2水合α，α–海藻糖，2分子椅式吡喃型D–葡萄糖均通過端基的α構(gòu)型連接而成，與Liu W等［6］報(bào)道一致。

確定海藻糖的結(jié)構(gòu)式(如圖2所示)及晶體結(jié)構(gòu)。

圖2 海藻糖的結(jié)構(gòu)式

2.2 均勻性檢驗(yàn)

在對(duì)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分裝后，進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品純度均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表3 均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表 3 可知，F(xiàn)=MS組間／MS組內(nèi)≈ 1.84，F(xiàn)(0.05，14，30)=2.04，F(xiàn)＜F(0.05，14，30)，說明在 95% 的置信區(qū)間，海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

因?yàn)楹Ｔ逄切再|(zhì)穩(wěn)定，所以選擇在高溫條件下加速樣品的化學(xué)或物理變化，模擬出樣品在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件下的變化，考察樣品的穩(wěn)定性，為樣品的包裝、運(yùn)輸、存儲(chǔ)提供資料。在40℃條件下24個(gè)月內(nèi)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

采用直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)海藻糖長(zhǎng)期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［7–8］，計(jì)算可得斜率|a|＜t0.95，n-2s(a)，故斜率不顯著，因而未觀測(cè)到不穩(wěn)定性，說明在該存儲(chǔ)條件下，海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性良好。參照中國(guó)藥典(2010版)［9］的相關(guān)說明，可以將海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期暫定為2年。

2.4 定值結(jié)果及其不確定度評(píng)定

2.4.1 定值結(jié)果

按照GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)要求，采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，選擇獲得國(guó)家或部門認(rèn)可、具備資質(zhì)的8家實(shí)驗(yàn)室對(duì)研制的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值。隨機(jī)抽取8瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送1瓶，采用離子色譜法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定量，定值結(jié)果見表5。

表5 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果匯總 %

匯集各家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)后，對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗(yàn)組內(nèi)數(shù)據(jù)的異常值，結(jié)果沒有異常值，則所有數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)［10］。再用Grubb’s法對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的平均值進(jìn)行檢驗(yàn)，將其看成一組測(cè)定值進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，結(jié)果無異常值。因此將各家實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的數(shù)據(jù)作為無偏估計(jì)值，計(jì)算8家實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后對(duì)各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s進(jìn)行Cochran檢驗(yàn)，按式(1)計(jì)算統(tǒng)計(jì)量C：

式中：si——各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

smax——si中的最大值。

計(jì)算 得 C=0.685，查表得 C8，6(0.05)=0.360，C ＞C8，6(0.05)，表明各實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)量不屬于等精度測(cè)量，因此計(jì)算加權(quán)平均值作為最佳值得到海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果(總平均值X=99.72%)。

2.4.2 定值結(jié)果的不確定度評(píng)定

根據(jù)GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測(cè)量不確定度u由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)的不確定度u(X)、均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度ults組成。依據(jù)全部測(cè)定結(jié)果，計(jì)算海藻糖樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

(1)標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)引入的不確定度u(X)。按照加權(quán)法計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度u(X)=0.08%。

(2)均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度ubb。該項(xiàng)用瓶間方差表示，計(jì)算得ubb=0.02%。

(3)穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度ults。由2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)可以計(jì)算得ults=s(a)t=0.09%。

則標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度：取包含因子k=1.96，則擴(kuò)展不確定度：U95=ku=1.96×0.13%=0.26%

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果為(99.72±0.26)%，k=1.96。

3 結(jié)語

研制的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察其均勻性、穩(wěn)定性均符合要求，該標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)食品安全、生物醫(yī)藥等方面的測(cè)量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］ 馬文錦，劉樹興，潘巨忠，等.海藻糖的生產(chǎn)制備及應(yīng)用前景［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007，24: 199–201.

［2］ 汪斌，盧曉華，孟凡敏.2001年以來我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展?fàn)顩r概述［J］.江蘇現(xiàn)代計(jì)量，2009(5): 34–36.

［3］ 陳暉，易瑞灶，謝榮偉，等.基于離子色譜法的海藻糖檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)海洋藥物，2012(1): 34–37.

［4］ GB／T 15000.3–2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3) 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法［S］.

［5］ 田媛，張尊建.糖類結(jié)構(gòu)的核磁共振波譜及質(zhì)譜分析［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2003(2): 78–80.

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［7］ 劉德富.藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24(4): 185–188.

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［9］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版［M］.二部.附錄199–201.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［10］ 陳偉珠，謝全靈，張怡評(píng)，等.4，9–脫水河豚毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2014，23(3): 1–4.