張東亮，何媛媛，杜 菲，李宏軍

（山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

0 引言

麥仁是小麥脫去種皮后的籽仁，為全麥谷物顆粒，擠壓膨化后處理的麥仁能夠使淀粉分子發(fā)生重排、蛋白適度變性，將膨化后的麥仁用作啤酒釀制輔料，能明顯增加成品酒的出品率[1-2].小麥中谷蛋白和醇溶蛋白的含量占蛋白質(zhì)總量的80%～90%，將小麥用于啤酒釀造中，其高分子氮比例明顯提高，并對啤酒泡沫穩(wěn)定性有明顯改善作用[3-4].

泡沫的評價(jià)可分為起泡性、泡沫穩(wěn)定性和泡沫質(zhì)量3 個(gè)方面，而在這3 個(gè)泡沫性能中，泡沫穩(wěn)定性因使得消費(fèi)者能最為直觀地評價(jià)啤酒的好壞而備受關(guān)注[5].國內(nèi)外研究者證實(shí)，蛋白質(zhì)對泡沫的穩(wěn)定性起非常重要的作用，其中分子質(zhì)量在15～40 ku 的高分子質(zhì)量蛋白是起主要穩(wěn)定作用的蛋白[6-9].另外蛋白質(zhì)是引起啤酒渾濁的主要因素之一，又是呈現(xiàn)口感、構(gòu)成泡沫、泡持性、掛杯等特性不可或缺的物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量過低，會顯著降低啤酒的口感，影響啤酒泡沫的形成及其品質(zhì)；而蛋白質(zhì)含量過高，又可影響啤酒膠體溶液的非生物穩(wěn)定性[10].

在啤酒釀造過程中大分子蛋白質(zhì)的含量明顯減少，中分子蛋白質(zhì)的含量基本保持不變，而小分子蛋白質(zhì)含量所占比例明顯有所提高[11]，其中蛋白質(zhì)在制麥及糖化過程中的變化最顯著，其含量和分布均呈下降的趨勢[12].

應(yīng)用葡聚糖凝膠過濾色譜法對以擠壓膨化麥仁為輔料制得的麥汁及發(fā)酵后啤酒中蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離，并利用Folin-酚法和SDS-PAGE 技術(shù)分別對分離出的麥仁麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行測定，得到麥仁麥汁和啤酒中蛋白質(zhì)的含量和分子質(zhì)量的分布范圍.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

自制單螺桿擠壓機(jī)：自制，山東理工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工中心；DWF-100 型電動植物粉碎機(jī)：河北省黃驊市科研器械廠；AuY-220 型電子分析天平：島津制作所試驗(yàn)計(jì)測事業(yè)部；UV-1700 型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；722S 型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGLl-16C 型臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BSZ-100 型自動部分收集器、HL-2 型恒流泵：上海青浦滬西儀器廠；層析柱：2.6 mm×100 mm，上海滬西分析儀器廠；DYT-8C 型電泳儀、DYCZ-24DN 型電泳槽：北京六一儀器廠.

1.2 擠壓麥仁輔料啤酒麥汁制備

麥仁調(diào)整水分含量為20%，擠壓機(jī)套筒溫度為120 ℃，?？字睆? mm，螺桿轉(zhuǎn)速180 r/min，擠壓后粉碎作為輔料加入水及大麥芽制備麥汁，圖1為麥汁制備工藝流程.

圖1 麥汁制備過程Fig.1 Wort-making process

1.3 擠壓麥仁輔料啤酒發(fā)酵工藝

啤酒酵母麥汁中培養(yǎng)3 d，接入冷卻后的麥汁中（7 ℃），接種量為2 L/100 L 麥汁，發(fā)酵過程溫度控制見圖2，發(fā)酵完畢后過濾，并取樣檢測.

圖2 發(fā)酵過程溫度控制過程Fig.2 Temperature control of fermentation

1.4 G-75 葡聚糖凝膠層析

首先將麥汁和啤酒樣品在10 000 r·min-1的條件下離心20 min，然后以超聲波（20 kHz）進(jìn)行30 min 脫氣處理.取處理后的樣品10 mL 上柱，用緩沖鹽（醋酸-醋酸鈉）溶液洗脫，溫度控制在室溫（18～20 ℃），流速為0.7 mL·min-1，每7.0 min 收集一管，即每管樣品體積為4.9 mL，麥汁和啤酒試樣各收集120 管，每個(gè)樣品平行測定3 次.為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品分離完，在相同的條件下，用緩沖液沖洗柱子12 h，然后再進(jìn)行下一個(gè)樣品的收集.將紫外分光光度計(jì)的波長設(shè)置在280 nm 處，測定每管洗脫后收集液的吸光度值，并繪制凝膠過濾色譜圖.

1.5 福林-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

采用福林-酚法測定各分離組分中蛋白質(zhì)的含量[13]，并以下列公式計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度.

1.6 SDS-PAGE 測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量

上樣緩沖液10 mL 含2.5 mL 1 mol/L 的Tris-HCL（pH 6.8），1 g SDS，50 mg BPB，5 mL 甘油.麥汁過濾后，取2 mL，1:1 加入丙酮，5 000 r·min-1離心5 min，沉淀物加蒸餾水100 μL 溶解，以4∶1 的體積比加入上樣緩沖液，煮沸5 min.電泳采用垂直電泳法，分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和5%.

2 結(jié)果與分析

2.1 G-75 葡聚糖凝膠層析

將低溫?cái)D壓膨化麥仁輔料麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽組分在1.4 所述條件下進(jìn)行凝膠色譜層析，繪制的色譜分離圖見圖3.

圖3 啤酒和麥汁中蛋白質(zhì)和多肽的凝膠色譜分離圖Fig.3 Gel chromatography of protein and polypeptide in beer and wort

從圖3 可以看出，麥汁和啤酒中均有兩個(gè)較顯著的峰，且峰形相似.出峰位置稍有不同，但基本一致，峰高和峰面積不同.兩種試樣均分離出3種組分，首先被層析分離出來的物質(zhì)為組分一，此組分為高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，因含有此組分的收集管數(shù)量較少，故兩種試樣中的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量較低.因組分三的峰值較為明顯，且組分三的成分為小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，兩種試樣中的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量較高.

2.2 Folin-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

2.2.1 蛋白質(zhì)分離液收集

將上述相同組分試管中的收集液混合，因組分一和組分二中蛋白質(zhì)含量較低，所以將該兩種組分混合在一起，然后使用福林酚法測定混合液中蛋白質(zhì)含量.各混合液收集方法如表1 所示.

表1 蛋白質(zhì)收集方法Table 1 Collection method of protein

2.2.2 Folin-酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的含量（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以500 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4 所示，線性回歸方程是y=0.002 1x+0.006 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9.說明蛋白質(zhì)濃度與500 nm 處的吸光值在溶液濃度為0～250 μg·mL-1范圍內(nèi)具有較好的線性相關(guān)性，所以此方法可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定量分析.

圖4 福林-酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard line of foline-phenol

2.2.3 福林-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

采用福林-酚法測定各分離組分中蛋白質(zhì)的含量，由于組分一、二混合液中蛋白質(zhì)的含量較低，將該混合液濃縮至1/10，測出組分一、二混合液及組分三的吸光度值，每個(gè)試樣平行測定3 次，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出蛋白質(zhì)含量，在測定過程中適當(dāng)稀釋樣品濃度，使稀釋后樣品中蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)，以提高精確度，結(jié)果如表2 所示.

表2 蛋白含量測定結(jié)果Table 2 Results of protein content

從表3 可以看出，麥仁麥汁中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為48 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為6 842 μg·mL-1，則麥仁麥汁中的總蛋白質(zhì)含量為6 890 μg·mL-1；麥仁啤酒中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為67 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為4 072 μg·mL-1，麥仁啤酒中總蛋白質(zhì)含量為4 139 μg·mL-1.

2.3 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定

聚丙烯酰胺凝膠電泳測定3 種組分的分子質(zhì)量范圍，結(jié)果如圖5 所示，A、B 條帶為麥汁，上樣量分別為10 μL 和5 μL；C、D 條帶為啤酒中蛋白，上樣量分別為10 μL 和5 μL；E、F 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，條帶E 為低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量范圍120～20 ku），條帶F 為超低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量范圍40～10 ku）.

圖5 樣品蛋白質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳圖Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）of protein in sample and standard marker

用10 μL 上樣量的條帶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比較，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量和相對距離求出低溫?cái)D壓膨化麥仁輔料麥汁及啤酒中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，采用Gelpro32 軟件對電泳圖中的條帶進(jìn)行標(biāo)記處理，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相對偏移距離（圖6）及樣品蛋白條帶相對偏移距離（圖7）.

圖6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相對偏移距離Fig.6 Relative offset distance of protein marker

圖7 樣品蛋白條帶相對偏移距離Fig.7 Relative offset distance of protein in sample

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的對數(shù)和相對遷移率[14]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品蛋白質(zhì)的相對遷移率與得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，求出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量.

以Gelpro analysis 分析圖6、圖7，可得出低溫?cái)D壓膨化麥仁輔料啤酒麥汁中的蛋白質(zhì)和多肽分子質(zhì)量主要集中在8～18.4 ku（組分三）、31～36 ku（組分二）和37～45 ku（組分一）3 個(gè)范圍區(qū)間內(nèi)，其中分子質(zhì)量范圍在8～18.4 ku 的小分子質(zhì)量蛋白能導(dǎo)致啤酒渾濁，而較大分子質(zhì)量蛋白則有利于泡沫穩(wěn)定性.由于這三部分范圍區(qū)間之外還存在著部分顏色較淺的條帶，這說明麥汁還存在著介于這三部分之間且含量較少的蛋白質(zhì)和多肽組分.

3 結(jié)論

采用葡聚糖凝膠過濾色譜法對低溫?cái)D壓膨化麥仁輔料所得麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離，結(jié)果表明：麥汁以及啤酒中蛋白質(zhì)的組成和分子質(zhì)量分布相似，都有兩個(gè)比較明顯的蛋白質(zhì)和多肽組分，且出峰位置相似，只是峰高和面積有所不同；采用福林酚法測定分離出的麥汁和啤酒中各組分的蛋白質(zhì)含量結(jié)果表明：麥仁麥汁中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為48 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為6 842 μg·mL-1，則麥仁麥汁中的總蛋白質(zhì)含量為6 890 μg·mL-1；麥仁啤酒中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為67 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為4 072 μg·mL-1，則麥仁啤酒中總蛋白質(zhì)含量為4 139 μg·mL-1.采用SDS-PAGE 技術(shù)測定麥汁和啤酒中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，結(jié)果表明：擠壓膨化麥仁輔料啤酒及麥汁中的蛋白質(zhì)和多肽分子質(zhì)量主要集中在8～18.4 ku、31～36 ku 和37～45 ku 3 個(gè)區(qū)間內(nèi).在這3 部分之間還存在著顏色較淺的條帶，這說明麥汁中還存在著分子質(zhì)量介于這3部分之間且含量較少的蛋白質(zhì)和多肽組分.

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