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        洋蔥黃酮超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

        2015-03-27 08:13:04趙二勞范建鳳任光明武宇芳袁一柯
        關(guān)鍵詞:洋蔥清除率黃酮

        賈 楠,趙二勞*,范建鳳,任光明,武宇芳,袁一柯

        (忻州師范學(xué)院1.化學(xué)系;2.生物系,山西 忻州 034000)

        0 引言

        洋蔥(Allium cepa L.)為百合科草本植物,在我國廣為栽培,資源豐富.洋蔥以其肥大的肉質(zhì)鱗莖供食用,為人們所喜愛食物,素有“ 蔬中皇后”之美譽.洋蔥中含有黃酮類化合物,洋蔥中黃酮類化合物具有抑菌、抗癌、降血糖、降血脂、抗血小板凝聚和抗氧化等多種生物活性[1-4],在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.但由于黃酮類化合物不能在人體中直接合成,只能從食品中獲得[5],因此從天然產(chǎn)物中提取黃酮的研究受到人們的廣泛關(guān)注.目前,對洋蔥黃酮類化合物的提取及抗氧化活性研究已有一些報道,如劉安軍等[6]研究了洋蔥黃酮的熱水浸提工藝,王卓慧等[7]研究了洋蔥黃酮的乙醇提取工藝.王瑩等[8]采用微波輔助法,侯冬巖等[9]采用超聲波輔助法提取洋蔥黃酮,同時也初步研究了洋蔥黃酮的抗氧化活性[4,10].這些研究均取得了一些有意義的成果,但總體來說,洋蔥黃酮的相關(guān)研究還較少,且不夠系統(tǒng).基于超聲波輔助提取能夠利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、強烈空化效應(yīng)和攪拌作用等,造成植物細胞壁的破壞,加速有效成分進入溶劑,從而縮短提取時間,提高得率,避免高溫長時間作用對提取成分的影響[11].作者采用超聲波輔助提取洋蔥中黃酮類化合物,通過單因素分析結(jié)合正交試驗,優(yōu)化該提取工藝,并以清除DPPH·和·OH 法評價洋蔥黃酮的抗氧化活性,旨在為洋蔥資源的深度開發(fā)和綜合利用提供參考.

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        洋蔥購于當(dāng)?shù)厥卟耸袌?,洗凈切片,烘箱?0 ℃下烘干,過40 目篩制成洋蔥粉,裝瓶備用.

        蘆丁標(biāo)準品:北京化學(xué)試劑公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·):日本東京化成工業(yè)株式會社;2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸和硫酸亞鐵銨等試劑均為國產(chǎn)分析純.試驗用水為二次去離子水.

        1.2 儀器與設(shè)備

        KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;SP-723 型紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司;SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;AL204型電子分析天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GZX-9246 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海博遠實業(yè)有限公司.

        1.3 試驗方法

        1.3.1 洋蔥中黃酮類化合物的提取工藝流程

        洋蔥粉→稱質(zhì)量→浸泡→超聲提取→過濾→定容→提取液.主要工藝參數(shù):洋蔥樣品質(zhì)量2.0 g;浸泡時間10 min;提取液均定容為100 mL.其余按選定試驗條件進行.

        1.3.2 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的單因素試驗

        在基本試驗條件為乙醇體積分數(shù)50%、料液比(g/mL) 1 ∶20、超聲波功率280 W、超聲時間30 min 和提取溫度35 ℃的情況下,分別對乙醇體積分數(shù)(30%、40%、50%、60%、70%和80%)、料液比(g/mL)(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和1∶35)、超聲波功率(200、240、280、320、360 和400 W)、超聲時間(15、20、25、30、35 和40 min)和提取溫度(30、35、40、45、50 和55 ℃)進行單因素試驗,分析各因素對洋蔥黃酮得率的影響.

        1.3.3 洋蔥黃酮超聲輔助提取的正交試驗及驗證

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選擇對洋蔥黃酮得率影響較大的因素,進行正交設(shè)計試驗,優(yōu)化洋蔥黃酮超聲提取工藝,并按照優(yōu)化后的條件進行提取試驗.

        1.3.4 洋蔥黃酮得率的測定

        以蘆丁為對照品,參考文獻[2,4]方法,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系測定洋蔥黃酮含量.試驗測得蘆丁標(biāo)準曲線回歸方程為:A=0.011 4C+0.001 3,R2=0.999 6.試驗時直接吸取或適當(dāng)稀釋后吸取洋蔥提取液1.0 mL,置于10 mL 比色管中,按標(biāo)準曲線方法在510 nm 處測定吸光度,由回歸方程計算洋蔥提取液中黃酮濃度,按下式計算洋蔥黃酮得率:

        黃酮得率(%)=[黃酮提取量 (mg)/洋蔥質(zhì)量(mg)]×100.

        1.3.5 洋蔥黃酮抗氧化活性測定

        試驗采用清除DPPH·法和清除羥自由基(·OH)法評價洋蔥黃酮抗氧化活性,并以常用抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)作陽性對照.洋蔥黃酮清除自由基能力越強,則反映其抗氧化活性越強.

        1.3.5.1 清除DPPH·能力的測定

        試驗參照文獻[12-13]方法進行,在10 mL 比色管中,加入2.0 mL 質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL DPPH·溶液和不同體積的待測液,用水定容至刻度.室溫下反應(yīng)30 min 后,在最大波長517 nm 處測定吸光度,計算洋蔥黃酮對DPPH·的清除率.清除率計算公式為:

        清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100,

        式中:Ai為2 mL DPPH·溶液加入待測液體系的吸光度;Aj為只加待測液體系的吸光度;A0為只加DPPH·溶液體系的吸光度.

        同時利用半清除率(IC50)定量比較洋蔥黃酮與BHT 對DPPH·的清除能力,即抗氧化活性.

        1.3.5.2 清除羥自由基(·OH)能力的測定

        試驗參照文獻 [14]-[15]方法進行.在10 mL比色管中,依次加入1.0 mL 濃度為7.5×10-3mol/L的硫酸亞鐵銨溶液,1.0 mL 濃度為7.5×10-3mol/L的水楊酸溶液,1.0 mL 0.1%的H2O2溶液,用水定溶至刻度,置于37 ℃水浴中恒溫反應(yīng)30 min 后,在波長510 nm 處測其吸光度為A0,在上述體系中加入洋蔥黃酮提取液測定吸光度為Ai,僅洋蔥黃酮提取液的吸光度為Aj.計算洋蔥黃酮對·OH 的清除率,清除率計算公式為:

        清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100.

        同時利用半清除率(IC50)定量比較洋蔥黃酮與BHT 對·OH 的清除能力,即抗氧化活性.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的單因素試驗

        2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響(表1)

        表1 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響Table 1 Effect of volume fraction of ethanol on flavonoids yield

        由表1 可知,隨乙醇體積分數(shù)的增大,洋蔥黃酮得率增加,當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時,黃酮得率達到最大.當(dāng)乙醇體積分數(shù)大于60%時,黃酮得率有所下降,其原因可能是乙醇體積分數(shù)過大,導(dǎo)致一些醇溶性雜質(zhì)溶出增多,干擾了黃酮的溶出.因此,選擇乙醇體積分數(shù)為60%.

        2.1.2 料液比的影響(表2)

        表2 料液比對黃酮得率的影響Table 2 Effect of ratio of material to liquid on flavonoids yield

        由表2 可見,料液比對洋蔥黃酮得率的影響較大.在料液比為1∶20 前,隨料液比增大洋蔥黃酮得率增加,當(dāng)料液比大于1∶20 后,得率增加緩慢,從節(jié)約成本和后續(xù)處理的方便考慮,選擇料液比(g/mL)為1∶20.

        2.1.3 超聲波功率的影響(表3)

        表3 超聲波功率對黃酮得率的影響Table 3 Effect of ultrasound power on flavonoids yield

        由表3 可見,洋蔥黃酮得率隨超聲波功率的增大而增加,當(dāng)超聲波功率為320 W 時,洋蔥黃酮得率達到最大.但超聲波功率大于320 W,黃酮得率反而有所下降,其原因可能是超聲波功率過高,會導(dǎo)致黃酮降解和其他雜質(zhì)溶出增加.因此,試驗選擇超聲波功率為320 W.

        2.1.4 提取時間的影響(表4)

        表4 提取時間對黃酮得率的影響Table 4 Effect of extracting time on flavonoids yield

        由表4 可見,提取時間為30 min 時,洋蔥黃酮得率最大,此后得率下降.其原因可能是由于超聲波作用時間太長,會使洋蔥組織中大量細胞破裂,導(dǎo)致細胞內(nèi)許多不溶物和黏液質(zhì)等進入提取液,增大傳質(zhì)阻力,影響有效成分黃酮的溶出.因此試驗選擇提取時間為30 min.

        2.1.5 提取溫度的影響(表5)

        表5 提取溫度對黃酮得率的影響Table 5 Effect of extracting temperature on flavonoids yield

        由表5 可見,隨著超聲溫度的升高,洋蔥黃酮得率增加,但增加緩慢.其原因可能是溫度升高,分子運動速度加快,滲透擴散也加快,利于黃酮類化合物溶出.從經(jīng)濟價值、操作方便等方面考慮,選擇超聲溫度為35 ℃.

        2.2 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的正交試驗

        根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,選取乙醇體積分數(shù)、超聲波功率、料液比和提取時間為因素,選用L9( 34)正交表進行4 因素3 水平的正交試驗,優(yōu)化超聲波輔助提取洋蔥黃酮的工藝條件,因素與水平設(shè)計見表6,試驗結(jié)果見表7.

        由表7 中極差R 直觀分析可知,影響洋蔥黃酮得率因素的大小順序依次為:乙醇體積分數(shù)>超聲波功率>料液比>提取時間,超聲輔助提取洋蔥黃酮的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3,即乙醇體積分數(shù)60%,超聲波功率360 W,提取時間30 min,料液比(g/mL)為1∶25.

        表6 因素與水平Table 6 Factors and levels of orthogonal test

        表7 正交試驗結(jié)果Table 7 Results of orthogonal test

        2.3 驗證試驗

        為了進一步考察優(yōu)化工藝的可靠性和穩(wěn)定性,精確稱取2.0 g 洋蔥,在確定的優(yōu)化工藝條件下進行3 次平行提取試驗,測得洋蔥黃酮得率分別為1.18%、1.20%和1.23%,平 均 為1.20%,RSD 為2.13%.試驗表明,此工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好.

        2.4 洋蔥黃酮清除DPPH·的能力

        洋蔥黃酮與BHT 對DPPH·的清除率測定結(jié)果見圖1.由圖1 可知,洋蔥黃酮對DPPH·的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大,呈較好的量效關(guān)系.由圖1 求得洋蔥黃酮與BHT 清除DPPH·的IC50分別為8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL.表明洋蔥黃酮清除DPPH·的能力明顯強于抗氧化劑BHT,即洋蔥黃酮具有較強的抗氧化活性.

        2.5 洋蔥黃酮清除·OH 的能力

        洋蔥黃酮與BHT 對·OH 的清除率測定結(jié)果見圖2.由圖2 可知,洋蔥黃酮對·OH 的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大,量效關(guān)系明顯.求得洋蔥黃酮與BHT 清除·OH 的IC50分別為11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL.可見洋蔥黃酮清除·OH 的能力略強于BHT,也表明洋蔥黃酮具有較強的抗氧化活性.

        圖1 洋蔥黃酮和BHT 對DPPH·的清除率Fig.1 Scavenging rate on DPPH·of flavonoids and BHT

        圖2 洋蔥黃酮和BHT 對·OH 的清除率Fig.2 Scavenging rate on·OH of flavonoids and BHT

        3 結(jié)論

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗,確定了影響洋蔥黃酮得率的大小因素依次為:乙醇體積分數(shù)>超聲功率>料液比>提取時間,超聲波輔助提取洋蔥黃酮的最佳工藝條件為A2B3C2D3,即以體積分數(shù)60%的乙醇為提取劑,在35 ℃、料液比(g/mL)為1∶25、超聲功率360 W 的條件下,超聲波輔助提取30 min.在此條件下,洋蔥黃酮得率可達1.20%.洋蔥黃酮與BHT 清除DPPH·的IC50分別為8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL;清除·OH 的IC50分別為11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL,洋蔥黃酮對DPPH·和·OH的清除能力均強于BHT,表明洋蔥黃酮具有較強的抗氧化活性.

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